内蒙古巴彦淖尔市部分规模化牛场产肠毒素大肠杆菌F5流行病学调查

为了解内蒙古巴彦淖尔地区规模养殖场由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F5菌毛引起的腹泻流行情况,采集巴彦淖尔市规模化养牛场284份血样和300份粪样,采用ELISA和PCR方法进行了产肠毒素大肠杆菌F5抗体及分子流行病学调查,结果显示:产肠毒素大肠杆菌F5抗体总阳性率为6.34%,抗原总阳性率为27.00%;在采集的样品中,0~2月龄犊牛的抗原阳性率最高,为20.67%,抗体阳性率为4.23%,表明巴彦淖尔地区ETEC F5在0~2月龄犊牛中流行,应进一步开展犊牛腹泻疾病的防控。

产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达

应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。

利用绿色荧光蛋白标记产肠毒素大肠杆菌F4ac

利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4ac中,获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结果显示,转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因,且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光;将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验,在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性,且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.

产肠毒素大肠杆菌F17菌毛黏附亚基单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

为获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F17菌毛黏附亚基G的单克隆抗体(MAb)及其抗原表位信息,本研究通过原核表达系统表达了重组F17-G蛋白(rF17-G-His)并纯化,SDS-PAGE和western blot检测结果显示表达的rF17-G-His大小为53 ku,纯化后条带单一。利用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了F17-G的MAb并制备腹水,采用间接ELISA、SDS-PAGE、western blot、抗体亚类鉴定试剂盒对所获得的MAb进行鉴定。结果显示,获得了3株可稳定分泌MAb的阳性杂交瘤细胞株F2G、C3G、E5G。3株MAb亚类均为IgG1,轻链为κ链,其中MAb F2G效价最高,上清效价为1:2 048,腹水效价为1:1 000 000。3株MAb均不与其他菌毛反应,具有较强的特异性。其中MAb E5G可以有效抑制ETEC DN1502株黏附肠上皮细胞。对MAb识别的抗原表位鉴定和分析结果显示,MAb F2G识别的抗原表位区域是aa1~aa15:1AAVSFIGSTENDVGP15,MAb C3G识别的表位区域是aa211~aa225:211GTTSLKLQCDAGVTV225,二者均为线性表位。MAb E5G识别的是构象表位,且位于凝集素结构域第89位天冬氨酸。采用软件分析F17-G生物学特性,结果显示,F17-G是稳定的亲水性蛋白,aa1~aa15是较活跃的表位区域,aa1~aa15、aa211~aa225在变体F17-G1、F17-G2中较为保守,aa89在3个变体中均高度保守。综合分析后认为MAb E5G具有预防和治疗携带F17菌毛ETEC引发的疾病的潜力。本研究为相应疾病的新型药物、诊断方法和疫苗的研发提供了有效生物制剂和可靠的生物学信息。

产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛抗体的方法,本研究以纯化的重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法,并对该方法的反应条件进行了优化。确定ELISA最佳条件为:包被抗原浓度为3.5 ng/孔;5%脱脂奶封闭液封闭2 h;血清最佳稀释度为1∶3 200、血清最佳作用时间为1 h;酶标二抗的最佳作用时间为1 h。该方法对F5、F6菌毛阳性血清和猪链球菌阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。其组内和组间的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用建立的间接ELISA方法检测血清并采用PCR方法检测其肛拭子进行符合性试验,其总符合率为96.2%。临床检测312份未经ETEC免疫的猪血清,阳性率为9.9%。表明该方法可以用于ETEC F4菌毛抗体的临床检测。

牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigentic E.coli,ETEC)的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg2+、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,在优化条件的基础上,确定多重PCR的特异性和灵敏性,以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测,结果2株为F41、K99和STa阳性,4株为F41、STa阳性,1株为K99、STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明,该方法特异性强、敏感性高、简便、快速,适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。

大肠杆菌F18菌毛操纵子全基因克隆、表达及生物学活性

利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌F18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码F18ab和F18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b(+),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。然后将克隆的重组载体DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3),构建和筛选出分别含F18ab和F18ac完整fed基因的重组菌,经过IPTG诱导表达,在电镜下观察到上述两种重组菌能分别大量表达F18ab和F18ac菌毛。用热抽提法提纯其诱导表达的F18ab和F18ac菌毛,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色发现提纯后菌毛获单一分子量约为15kDa蛋白条带,免疫家兔后制备出高效价的兔抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外诱导表达的F18ab和F18ac菌毛具有和野生F18菌毛相同的抗原性。用表达F18ab和F18ac菌毛的上述2株重组菌分别进行小肠上皮细胞体外吸附试验和吸附抑制试验,结果表明:2株重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而用表达F18ab和F18ac重组菌提纯的菌毛制备出兔抗血清都能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对易感仔猪小肠上皮细胞的吸附结合。

仔猪产肠毒素大肠杆菌F4受体研究进展

仔猪腹泻是养猪生产中的一种常见病和多发病,也是困扰规模化养猪生产的主要难题之一。其中,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是造成新生和断奶仔猪腹泻的最主要病原体。文章综述了产肠毒素大肠杆菌F4受体的数量性状基因座(QTL)定位、候选基因以及单核苷酸多态性(SNP)发现,并对今后F4受体研究的问题解决及系统验证进行了展望,以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。

大肠杆菌F_5菌毛胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线;组装试纸条,进行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验,并对模拟样品和临床样品进行初步检测。结果显示,对F5菌毛蛋白的最小检出量为38.2μg/mL;与大肠杆菌F4、F6、F41和F18ab菌毛无交叉反应;4℃条件下密封保存120d后仍能有效检出样品;批内、批间检测F5菌毛蛋白的结果没有差别且检测线清晰,具有良好的重复性;对14份临床样品检测的结果与间接夹心ELISA、平板凝集试验、PCR的符合率为100%。

黏附素F18菌毛研究进展

综述F18菌毛的一般特性、表达和提取、相关血清型和毒力因子、亚单位及基因调控等。

MUC4和MUC13基因在ETECF18抗性型和易感型梅山断奶仔猪间的差异表达分析

MUC4和MUC13基因作为产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC)F4的重要抗性候选基因,可能在断奶仔猪抗ETEC F18菌株的感染过程中发挥重要作用,因此本试验运用实时荧光定量PCR法分析了MUC4和MUC13基因在梅山猪ETEC F18抗性型和易感型个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠)中的表达水平及差异。结果显示,MUC4和MUC13基因在检测的11个组织中均有不同程度的表达。其中,在胸腺和淋巴组织中,MUC4基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05);在肺脏组织中,MUC13基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05),且MUC13基因在抗性群体肠道中的表达水平较高。由此推测,MUC4基因在免疫组织、MUC13基因在肠道组织的高表达可在一定程度上提高了机体的免疫能力,保护和润滑肠道,从而抵抗ETEC F18菌株对机体的感染。

ETEC F4-F5融合基因表达及间接ELISA方法建立

表达产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)黏附素F4和F5融合蛋白,建立间接ELISA方法,旨在监测猪场ETEC感染以及疫苗免疫情况。根据GenBank中登录F4和F5基因序列,分析保守区,优化密码子,合成F4-F5串联基因,克隆入原核表达载体,表达重组蛋白His-F4-F5。以纯化的His-F4-F5蛋白作为检测抗原,建立检测ETEC抗体的间接EIISA方法。经酶切和DNA序列分析,成功构建重组菌BL21(pCold I-F4-F5),SDS-PAGE和Western blot分析,融合表达F4-F5相对分子质量为29 000,与ETEC高免血清发生特异性反应,条带单一。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件:抗原包被浓度6ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-羊抗猪二抗的工作浓度1∶15 000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间15min。本研究建立F4-F5间接ELISA方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强的特点,是猪场ETEC感染和疫苗免疫效果检测的有效工具,进而指导疫苗使用和新型疫苗研发。

PRRSV ORF5和ETEC faeG基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

分别以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株JL-12的cDNA和产肠毒素大肠杆菌质粒为模板,PCR扩增ORF5和faeG基因,对扩增产物进行鉴定和测序,并构建重组表达质粒pGAPZαA-ORF5、pGAPZαA-ORF5-FaeG,将pGAPZαA-ORF5与pGAPZαA-ORF5-FaeG分别转入毕赤酵母表达系统中构建重组菌,获得分泌表达蛋白的重组酵母菌,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。SDSPAGE分析结果显示,分别得到分子质量约为24ku的GP5蛋白和52ku的GP5-FaeG融合蛋白。Western-blot分析结果显示,GP5蛋白、GP5-FaeG融合蛋白都具有反应原性。上述研究结果为PRRSV的分子生物学功能和基因工程疫苗的研发奠定了基础。