槲皮素对产肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪肠上皮细胞凋亡和焦亡信号通路的影响

本试验旨在研究槲皮素(Que)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪肠上皮细胞损伤、炎症反应、凋亡和焦亡信号通路的影响。试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,分为4组:对照组、Que组、ETEC K88组、Que+ETEC K88组。用0或10μmol/L Que处理细胞24 h后,再用磷酸盐缓冲液(PBS)或50倍细胞数的ETEC K88刺激细胞2 h,收集样品测定细胞活力、细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞中炎性因子含量、细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因的mRNA表达水平。结果显示:1)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞活力的下降和细胞上清液中LDH活性的上升(P<0.05)。2)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的上升(P<0.05)。3)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞凋亡信号通路相关基因凋亡相关因子配体(FasL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平的上升和B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的mRNA表达水平的下降(P<0.05)。4)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞焦亡信号通路相关基因含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、IL-18、消皮素D(GSDMD)和NLR家族CARD结构域4(NLRC4)的mRNA表达水平的上升(P<0.05)。综上所述,Que可抑制ETEC K88刺激导致的IPEC-1细胞凋亡和焦亡信号通路的激活,缓解细胞损伤。

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用 PCR从产肠毒素性大肠杆菌 ( ETEC)中扩增出不含信号肽序列的 K99菌毛蛋白基因片段 ,克隆测序后 ,将该片段连接到 E.coli表达载体 p ET2 8a( + )中 ,转化 E.coli表达菌株 BL2 1 ( DE3) ,筛选得到可诱导表达 K99抗原的工程菌株。经 IPTG诱导 ,分离纯化 K99重组蛋白 ,以其免疫新西兰大白兔 ,获得重组蛋白的兔抗血清 ;免疫印迹分析表明 ,此重组蛋白制备的抗血清能与标准的

产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达

目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术,构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测,证明外源基因已经整合到受体植物基因组中,同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得,为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。

产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究

为研究K88ab/K88ad菌毛对细胞的黏附作用,本研究分别以产肠毒素E.coli(ETEC)K88ab C83901株和K88ad C83903株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增这两种K88菌毛操纵子fae基因(均约7.9 kb)。将其分别克隆于表达质粒pBR322中构建pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒,并将其分别转化至不含任何菌毛的E.coli SE5000株中。该重组菌能够分别与鼠抗K88菌毛阳性血清和抗K88菌毛单克隆抗体(MAb)产生凝集反应;在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛。采用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛,SDS-PAGE电泳检测结果显示,菌毛蛋白的分子量约为26 ku。玻板凝集试验和western blot结果表明:重组表达的K88ab及K88ad菌毛与K88+参考株菌毛均能够被抗K88菌毛阳性血清和MAb识别。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附和黏附抑制试验,结果表明表达K88菌毛的重组菌及K88+参考株均能够黏附于IPEC-J2上皮细胞表面;而且阳性血清和MAb能够有效抑制重组菌或K88+参考株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。

K88ac^(+)产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

为研究热敏肠毒素(LT)对K88ac+产肠毒素大肠杆菌(K88ac^(+)ETEC)致病能力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了eltAB基因缺失株C83902ΔeltAB,同时将重组质粒pBR322-eltAB电转化至C83902ΔeltAB菌株中获得回补株C83902ΔeltAB/pLT。比较3株菌的生长特性,结果显示相同的条件下,野生株、缺失株和回补株的生长速度无差异;采用ELISA方法检测3株菌感染仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2后细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度,结果显示与缺失株相比,野生株和回补株感染后细胞内的cAMP浓度均极显著上升(P<0.01)。体外对IPECJ2细胞的黏附试验结果显示,缺失株的黏附能力较野生株极显著下降(P<0.01);而回补株的黏附能力得到恢复。采用RT-qPCR检测3种菌株感染IPEC-J2后炎性因子和紧密连接蛋白基因的转录水平,结果显示缺失株感染IPEC-J2细胞后,炎性因子TNF-α和IL-8的mRNA转录水平均极显著下降(P<0.01),而3株菌感染的细胞中紧密连接蛋白编码基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA转录水平均无变化。以上结果表明,LT毒素能够促进K88acETEC菌株对IPEC-J2细胞的黏附和诱导其炎性细胞因子的分泌,但并不能破坏肠道细胞屏障的完整性。本研究为进一步阐明K88acETEC的致病机制提供了重要的参考依据,同时为防治K88acETEC的感染提供了新的策略。

饲用凝结芽孢杆菌对感染产肠毒素大肠杆菌K88断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响

本文旨在研究饲用凝结芽孢杆菌对感染产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88断奶仔猪生长性能和肠道菌群、形态及细胞因子表达的影响。试验选用32头25日龄断奶的健康“杜×长×大”商品公猪,按照初始体重一致原则分成4个组,每组8个重复,单笼饲养。ETEC K88感染前7 d,2个组饲喂基础饲粮(BD组),另外2个组饲喂在基础饲粮中添加1.0×10^(7) CFU/g凝结芽孢杆菌的饲粮(PD组)。第8天起,开展2×2双因素试验,4个组设计如下:1)NCH+BD组,口服生理盐水、饲喂基础饲粮;2)NCH+PD组,口服生理盐水、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮;3)CH+BD组,口服ETEC K88、饲喂基础饲粮;4)CH+PD组,口服ETEC K88、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮。试验猪口服5 mL ETEC K88(活菌数1.0×10^(9) CFU/mL)或5 mL 0.9%生理盐水,持续3 d。试验用凝结芽孢杆菌是经体外牛津杯法确定的1株对ETEC K88具有良好抑菌效果的菌株,添加量1.0×10^(7) CFU/g。试验第11天,取仔猪空肠、回肠、盲肠及食糜样本,测定肠道菌群、形态及细胞因子表达量。结果表明:1)ETEC K88感染处理显著降低断奶仔猪平均日增重和平均日采食量、空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量、空肠和回肠绒毛高度以及空肠黏膜白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达量(P<0.05);同时,显著提高断奶仔猪料重比和腹泻指数、空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量、空肠和回肠隐窝深度以及空肠黏膜白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达量(P<0.05)。2)饲用凝结芽孢杆菌处理显著提高断奶仔猪平均日增重和平均日采食量、空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量、空肠和回肠绒毛高度以及空肠黏膜IL-10 mRNA表达量(P<0.05);同时,显著降低断奶仔猪料重比和腹泻指数、空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量、空肠和回肠隐窝深度以及空肠黏膜IL-6 mRNA表达量(P<0.05)。3)除腹泻指数外,ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对其他指标均无显著互作效应(P>0.05)。结果提示,无论是否ETEC K88感染处理,饲用凝结芽孢杆菌均可通过平衡肠道菌群、维持肠道正常形态和缓解肠道炎症反应,改善断奶仔猪生长性能。

饲粮添加迷迭香酸对产肠毒素大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响

本研究旨在探究饲粮添加迷迭香酸(RA)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响。选取18头体重为(6.91±1.02) kg的健康21日龄断奶仔猪,随机分为对照组(CON组)、攻毒组(K88组)和迷迭香酸组(RA组),每组6头仔猪。CON组和K88组每天饲喂基础饲粮,RA组每天饲喂含RA的试验饲粮(在基础饲粮基础上添加500 mg/kg RA)。试验第19~20天,K88组、RA组仔猪每天灌喂4 mL浓度为109CFU/mL的ETEC K88重悬液攻毒,对照组仔猪则每天灌喂同等剂量的无菌生理盐水。所有仔猪在试验第22天屠宰取样。结果显示:1)与CON组相比,K88组断奶仔猪腹泻指数显著增加(P<0.05);与K88组相比,RA组断奶仔猪腹泻率极显著降低(P<0.01)。2)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠隐窝深度和黏膜厚度极显著降低(P<0.01)。3)与CON组相比,K88组断奶仔猪结肠菌群Chao1和ACE指数显著降低(P<0.05)。4)在门水平上,与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度极显著降低(P<0.01),变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著降低(P<0.05),放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著增加(P<0.05);在属水平上,与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠菌群中克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)的相对丰度极显著增加(P<0.01),布劳特氏菌属(Blautia)、粪球菌属3(Coprococcus_3)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度显著增加(P<0.05),而脱硫弧菌属(Desulffovibrio)、埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的相对丰度显著降低(P<0.05)。5)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠食糜中乙酸、丁酸和总短链脂肪酸含量均显著增加(P<0.05)。6)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠黏膜中闭锁蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01)。7)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠黏膜中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量极显著降低(P<0.01),IL-10含量极显著增加(P<0.01),并且结肠黏膜中Toll样受体(TLR)-2(P<0.01)、TLR-4(P<0.01)、TLR-5(P<0.05)、核因子-κB(NF-κB)(P<0.01)的mRNA相对表达量显著或极显著降低。综上可知,饲粮添加RA可以改善ETEC K88攻毒断奶仔猪的结肠形态结构,调节结肠菌群组成,提高结肠食糜中细菌代谢产物短链脂肪酸的含量,有利于维持结肠屏障功能,缓解ETEC K88攻毒引起的结肠炎症反应,缓解断奶仔猪腹泻,维持肠道健康。

牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigentic E.coli,ETEC)的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg2+、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,在优化条件的基础上,确定多重PCR的特异性和灵敏性,以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测,结果2株为F41、K99和STa阳性,4株为F41、STa阳性,1株为K99、STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明,该方法特异性强、敏感性高、简便、快速,适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因。融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒。测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础。

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法。该方法对K88、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果 2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性。

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓度0.4mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。

干酪乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌粘附Caco-2细胞抑制作用的研究

为研究干酪乳杆菌(L.casei)对人结肠癌Caco-2细胞的粘附特点及抑制产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)粘附Caco-2细胞的能力,本研究将不同浓度的L.casei和ETEC K88与分化完全的Caco-2细胞共培养2 h和4 h后,采用平板计数法和革兰染色法计算每个细胞上粘附菌的个数,评价L.casei的粘附特点及其抑制ETEC K88对Caco-2细胞的粘附能力,并分析其影响因素。结果表明,L.casei与ETEC K88均可以粘附至Caco-2细胞表面,并且随菌液浓度的升高和培养时间的延长,粘附的数量显著增加(p<0.05)。L.casei浓度越高,抑制ETEC K88粘附至细胞表面的能力越强,并与菌液添加顺序有关,但培养时间对其影响不显著(p>0.05)。本研究为L.casei抑菌作用机制的研究提供了实验依据。

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

为调查川西北地区牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况,对采自川西北甘孜州和阿坝州的26份腹泻牦牛粪便样品进行大肠杆菌分离,分别以分离的大肠杆菌DNA和牦牛腹泻粪便样本提取的总DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,分析产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻中存在情况,同时比较两种DNA提取方法对产肠毒素大肠杆菌PCR检出率的差异;以分离自外表健康牦牛粪便的105株大肠杆菌DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,比较牦牛源产肠毒素大肠杆菌在外表健康牦牛和腹泻牦牛中的携带情况.结果:从26份牦牛腹泻粪便样本中共鉴定出84个大肠杆菌菌落携带K99菌毛基因,这些菌落分别来自所有26份牦牛腹泻样品,因此,牦牛腹泻样本100%分离并检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌;而粪便总DNA检测结果为K99+菌毛基因阳性率84.62%(22/26),粪便中提取的总DNA模板K99+菌毛基因PCR检出率略低于分离鉴定的细菌DNA检出率;105株外表健康牦牛粪便样本分离株中检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌34株,检出率为32.38%(34/105),产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康牦牛粪便的检出率(P<0.001).结果表明,产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中存在广泛,是引起牦牛腹泻的一种重要病原菌;以粪便中提取的总DNA为模板,可快速检测牦牛粪便中产肠毒素大肠杆菌的存在.

猪源产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88)和毒素(STa和LT)基因分别设计合成了1对引物,对K88、STa和LT基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、STa和LT的三重PCR方法。该方法对K88、STa和LT基因的扩增产物分别为499 bp,190 bp和373 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的三重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的三重PCR方法对实验室从临床腹泻样品中分离的120株大肠杆菌进行检测,结果 9株为K88/LT/STa阳性,14株为K88/LT阳性,21株K88/STa阳性,13株LT/STa阳性,8株K88阳性,2株LT阳性,12株STa阳性。

产毒性大肠杆菌菌毛K_(99)抗原单克隆抗体的研制及初步鉴定

本文应用Sephadex A-SO层析柱纯化的产毒性大肠杆菌(ETEC·O101·K99^+·H^-株)免疫BALB／c小鼠，取其脾脏细胞与Sp2／0—Ag14骨髓瘤细胞系融合，获得17株抗K99抗原杂交瘤细胞。对其中5C5细胞株经三次克隆化，100％阳性，传代三个月及液氨保存复苏，生长良好，并能持续分泌抗K99抗原的单克隆抗体．IF法测定杂交瘤细胞培养上清，阳性滴度为10^-2，诱生腹水阳性滴度为10^-4。免疫球蛋白类型鉴定为lgM。杂交瘤细胞经染色体鉴定为95条，证实为sp2／0与小鼠的杂交细胞。

产肠毒素大肠埃希菌K99菌毛基因的克隆与原核表达

本试验采用产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)K99菌毛基因完整编码框的特异性引物,以牛源大肠埃希菌C83912基因组DNA为模板,扩增出大小为498bp的ETEC K99菌毛基因完整编码框,克隆至pMD19-T载体,阳性重组质粒pMD19-T-K99经PCR、双酶切鉴定和测序正确后,双酶切产物与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a(+)-K99,转化原核表达工程菌BL21(DE3),阳性转化子经IPTG诱导获高效表达,Western blot证明原核表达的K99重组蛋白能与K99单因子血清发生特异性反应,重组蛋白免疫家兔后可产生特异性抗体,证明重组蛋白具有良好的抗原性。ETEC K99原核表达质粒的构建和表达产物抗原性研究,为进一步研究K99亚单位疫苗以及制备K99特异性抗体奠定了基础。

致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

肠毒素大肠杆菌((Ent erot oxi geni c E.col i,ETEC)是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本试验建立了多重PCR检测ETEC毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa、LT肠毒素相关基因的技术方法。试验对影响PCR扩增的dNTP、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,确定了多重PCR的特异性和灵敏性。结果表明:所建立的多重PCR方法快速、特异、灵敏,在2.5h-3h内就可以完成,为致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供另一种选择。

大肠杆菌野生株K_(99)菌毛蛋白结构基因的克隆与序列分析

根据产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99菌毛蛋白的全基因序列设计产肠毒素大肠杆菌主要菌毛K99的一对引物。PCR扩增K99菌毛蛋白的全基因序列大小为546bp。将PCR扩增的目的片断克隆于pMD18-T载体、pET-32a载体中,分别转化大肠杆菌,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA序列分析,筛选出阳性克隆。经过序列比对,所克隆的外源基因与报道的K99菌毛蛋白结构基因序列同源性达99.3%。成功克隆分离到的产肠毒素大肠杆菌菌毛的K99基因,为当地产肠毒素性大肠杆菌病疫苗的选择及基因疫苗的研制提供了坚实的理论基础,为产肠毒素性大肠杆菌病检测、预防及基因工程疫苗的研制开辟新的途径。