产转谷氨酰胺酶链霉菌的发酵罐生产工艺研究

针对研究室分离筛选的链霉菌 (Streptomycessp )WZFF W 12 varMN 3 5发酵生产微生物转谷氨酰胺酶 (MTG) ,首先采用自行设计的 2L小型生化反应器 ,研究以多价胨为主的有机氮源的影响作用 ,并在此基础上逐级扩大发酵罐规模 ,以 8L小型罐及 2 0～ 2 0 0L发酵罐组合并利用在线监控手段直接监测分析环境条件对MTG发酵过程中菌体生长和产酶的影响 ,进一步确定培养条件。研究结果表明 ,以 2 0 0L发酵罐发酵生产MTG时采用两级种子培养 ,氮源采用多价胨和豆饼粉 ,发酵过程中在线控制通气量和搅拌速度分别为 0 9～ 1 1vvm和 3 5 0～ 45 0r/min等优化条件最有利于菌体持续稳定生产MTG ,当发酵至 72h时酶活达到最高 ,在 2

链霉菌生产谷氨酰胺转胺酶的发酵工艺条件研究

以本实验室从土壤分离并经诱变筛选得到的链霉菌 Streptomyes sp.WZFF.W—12.var MN-35为出发菌株, 首先在摇瓶条件下,对微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发 酵生产过程中的主要培养基组成、培养条件及各种蛋白 酶抑制剂对菌体生长和产酶能力的影响进行了研究。结 果表明,发酵生产MTG的合适碳氮源分别为可溶性淀 粉与葡萄糖和多价胨,其最佳碳氮比(C/N)为5:5,适宜 的接种龄、接种量、初始pH、培养温度、搅拌速度等工艺 条件分别为24h、7％～10％、pH6.5～7.0、30℃和200r/min, MTG酶活最高可达1.63U/mL。当在优化培养基中进一 步加入一种蛋白酶抑制剂后,酶活又提高了19.0％。在这 些最佳工艺条件下采用简易的小型生化反应器培养该链 霉菌株,酶活稳定在2.0U/mL以上。

不同菌落形态的链霉菌对产谷氨酰胺转胺酶的影响

通过对链霉菌STK-203进行自然选育,挑选出5种不同菌落形态的单菌落。摇瓶发酵培养48 h后检测发酵液中的谷氨酰胺转胺酶的活性、残余氨基氮含量、残余甘油含量、菌种生物量等4种生理指标。结果表明,编号为Ⅰ即馒头型的单菌落的酶活最高,高达5.84 U/mL,其残余甘油含量为0.071 g/L,残余氨基氮含量为1.48 g/L,菌体浓度为36.01%。根据菌落形态和产酶的相关性,为产谷氨酰胺转胺酶的链霉菌STK-203菌株的选育和生产提供了一种简便有效的方法。

"神舟"4号空间飞行对搭载的转谷氨酰胺酶链霉菌选育的影响

目的利用"神舟"4号无人飞船搭载生产微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的链霉菌株,进行工业实用性微生物菌种的空间诱变育种研究,定向选育高产酶突变菌株。方法将产酶菌株链霉菌WZFF.L-M168(2.60 u/ml)以孢子和培养基中添加或不添加诱变剂亚硝基胍(NTG)的斜面培养形式搭载飞船后。采用蛋白质交联絮凝-沉淀实验方法初筛出正突变菌株,再采用摇瓶发酵产酶分析实验进行复筛驯化实验。结果实验首先发现在各种宇宙空间环境因素的综合作用下,搭载菌株的菌落形态发生明显变化,特定形态与产酶能力有一定正相关性。根据菌落形态特征从各搭载试管组中分离的733搭载突变株经系列选育驯化后,得到一系列MTG生产能力显著提高的优良搭载突变菌株。其中,最高产酶菌株在利用小型生化反应器进行发酵培养的产酶效果良好,酶活提高了40％以上,达到3.62 u/ml,超过现有国际最高水平。结论将产MTG菌种搭载"神舟"4号飞船,并进行严格的菌种驯化选育,获得了具优异性能的高产酶搭载突变株,表明空间诱变育种效果显著。

培养基组成对轮枝链霉菌合成谷氨酰胺转胺酶的影响

对产谷氨酰胺转胺酶菌种轮枝链霉菌 (Streptoverticillium )SK 1的摇瓶条件进行了研究 ,结果表明当起始 pH值为 6.5～ 8.0 ,氮源、碳源为蛋白胨与甘油 ,培养时间为 110h时 ,酶活最高可达 1.8μmol/ (min·mL) .

剪切力对链霉菌谷氨酰胺转胺酶发酵的影响

考察了以摇瓶发酵过程中添加玻珠为剪切力,对链霉菌(Streptomyces sp.)HS-1发酵生产谷氨酰胺转胺酶的影响,在10 L发酵罐上不同搅拌转速对产酶的影响。结果显示,摇瓶发酵中,在种子阶段添加玻珠,提高剪切力不能促进产酶;在发酵阶段,加入4颗玻珠时,酶活相对最高,比对照增加20%;36 h时添加玻珠,与对照相比,酶活提高12%,菌体浓度增加40%,且氨基氮消耗明显。10 L发酵罐中,适宜的搅拌转速为250 r/min,36 h调整转速至250r/min,酶活比维持90 r/min提高21%。因此剪切力对谷氨酰胺转胺酶发酵有明显影响。

吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶突变体的构建和酶学性质表征

根据茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶点突变的结果,用重叠延伸PCR法构建了3个吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶突变体Tyr81ValGly82Asn、Tyr133Phe、Tyr360Ala,在巴斯德毕赤酵母GS115中表达并对其酶学特性进行了表征。结果表明,野生型和3个突变体的最适温度为40℃,最适pH 7;除了甘油外,其他有机试剂都降低了TGase的酶活力;与野生型相比,突变体Tyr81ValGly82Asn、Tyr133Phe和Tyr360Ala的比活力分别提高了9%、85%和30%;3个突变体与野生型相比,K_(m)、K_(cat)和K_(cat)/K_(m)值有所升高,表明突变可能降低了TGase与底物的亲和力,却加速了其催化效率。上述结果为通过点突变提高吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活力提供了试验依据和途径。

吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶分离纯化方法改进及结构研究

利用改进的新方法,对吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶(TGase)进行分离纯化。将发酵上清液经过硫酸铵分级盐析后,用Hitrap Q HP阴离子交换柱除掉干扰较大的色素,之后又经Superdex 75 10/300GL凝胶柱和Hitrap Q HP阴离子交换柱的分离,得到高纯度的TGase。纯化后TGase的比活力可达24.5 U/mg,回收率为39.9%。TGase的N-末端前6个氨基酸经测序为DAADER。该研究是对吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列的首次报道。将吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列与已报道的其它3种链霉菌来源的TGase的N-端氨基酸序列进行比对,序列相似性不高。预测和分析了吸水链霉菌TGase的高级结构,为进一步研究TGase结构和功能的关系,蛋白分子定向改造提供理论依据。

Zn^(2+)对轮枝链霉菌SK4.001生长及转谷氨酰胺酶合成的影响

研究了Zn2+在SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶中的作用.在发酵培养基中加入不同质量浓度的Zn2+,检测菌体量、pH、残余甘油及转谷氨酰胺酶(TGase)酶活的变化,发现Zn2+在SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶中除满足菌体生长需要外,还具有提高转谷氨酰胺酶酶活的作用.发酵培养基中含有3.15μg/mLZn2+时,菌体生长正常,菌体量较高;当Zn2+质量浓度增加到8.15μg/mL时,菌体量改变不明显,但转谷氨酰胺酶酶活迅速上升,达到4.723U/mL,是Zn2+质量浓度为3.15μg/mL时的2.06倍.

土壤分离转谷氨酰胺酶生产菌株

根据转谷氨酰胺酶催化反应结果的特性 ,设计了一个利用廉价的酶作用底物实施的蛋白质交联凝絮 -沉淀性能测定方法 ,并将其作为初筛手段 ,用于从土壤中分离生产转谷氨酰胺酶微生物菌种。从 13 9株放线菌中经初筛和摇瓶发酵测定酶活的复筛试验筛选得到 10株产酶菌株 ,其中一株酶活达 0 2 4U/mL ,并对其进行分类鉴定实验 ,确定为链霉菌属 ,编号为Streptomycessp .WZFF .W 12。

产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其产酶条件研究

利用设计的低廉简便的凝胶法从土壤中分离得到1株高产谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutami-nase,MTG)的菌株,初步鉴定属于放线菌纲的链霉菌属(Streptomycessp.)。摇瓶发酵试验表明,其最适产酶氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖,通过正交试验确定最适产酶培养基为(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母提取物3.0,MgSO4·7H2O2.0,K2HPO4·3H2O2.0,KH2PO42.0,CaCO35.0。单因素试验确定最佳培养时间和最适pH分别为72h和7.0;在优化条件下,发酵液中MTG酶活达1.04U/mL。

Streptomyces sp.WJS-825产谷氨酰胺转胺酶发酵条件优化及中试

应用五因子二次正交旋转回归试验设计,建立了微生物谷氨酰胺转胺酶 (TG)发酵生产过程中以酶活力和菌体细胞生长量作为目标函数的数学模型,并以此模型对链霉菌 (Streptomycessp. )WJS-825菌株发酵生产TG的培养条件进行优化,确定了影响TG生产的主要因子及其最适取值为多价胨 2. 1%、可溶性淀粉 1. 5%、初始pH 7. 0及培养温度 30℃.以该优化工艺条件进行了 5L发酵罐小试和 200L发酵规模的中试生产.结果表明,在中试发酵生产中使用以豆饼粉部分替代多价胨的经济性发酵优化培养基,以及发酵过程中在线监控pH、溶氧系数等多项发酵调控参数,并分段控制pH、温度、通气量和搅拌转速以及进行适时的流加补充碳源,该菌株生长繁殖能力强、产酶效果好,TG活性达 3. 2u/mL,而且连续重复的中试发酵生产试验的TG产量均稳定在 3. 2u/mL以上. 图 2表 3参

微生物谷氨酰胺转胺酶高产菌株的诱变选育

以本实验室筛选的Streptomyces sp.WZFF.W-12(谷氨酰胺转胺酶活0.24U/ml)为出发菌株,孢子经预培养处理处于萌发状态后制备成单孢子悬浮液,用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)单独和结合羟胺进行多次复合诱变处理。实验发现,诱变处理后菌落的形态变异等特征与产酶能力呈相关关系,并被用于最初的突变菌落挑选。接着先后采用蛋白质交联凝絮-沉淀性能分析的初筛试验和摇瓶测定酶活的复筛试验分离选育高产酶突变菌株,最后获得一产酶活力达2.18U/ml的高产菌株W-12var HZ3,酶活相对提高了8倍。对该菌株进行分类鉴定方面的理化性能测试和传代实验结果表明,该菌遗传性较为稳定,而且其理化性能与已报道的产酶菌种明显不同。

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.

微生物谷氨酰胺转胺酶的分批发酵生产

在首先采用我们自行设计的2L小型、便易的生化反应器,对我们研究室保藏的高产酶菌株链霉菌(Streptomyces sp.)WZFF.L-M168发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)过程中发酵培养基的碳源、氮源和初始pH值的影响作用进行研究,确定培养条件后,逐级扩大发酵罐规模,在20L和200L发酵罐上以在线监控技术手段直接监测分析环境因素对MTG发酵生产的作用效果,确立各级发酵罐分批发酵的生产工艺条件。结果表明:碳氮源采用葡萄糖、淀粉和多价胨,初始pH值为7.0,接种量5%～10%,发酵过程中在线控制培养温度、pH、通气量和搅拌速度等各项参数指标分别为30±0.5℃、6.6～6.9,0.8～1.1vvm和200～400r/min较为适宜。在这优化技术条件下,200L发酵罐可以稳定生产酶活在2.75U/ml以上的MTG。

片段化全基因组体外诱变选育转谷氨酰胺酶高产菌株的研究

茂原链霉菌产生的转谷氨酰胺酶由于具有使蛋白质交联的特性而备受关注,但是其较低的产量阻碍了工业化的发展。本文采用一株分离到的茂原链霉菌作为出发菌株,通过片段化全基因组体外诱变育种的方法,最终得到一株转谷氨酰胺酶酶活为0.223U/mL的优良菌株,比出发菌株(0.0685U/mL)酶活提高近2.23倍。

转谷氨酰胺酶高产突变株的紫外线诱变选育及发酵条件研究

以茂源链霉菌为出发菌株,对其进行紫外线诱变,通过初筛复筛,选育出性能稳定的高产突变菌株G-17,其酶活力达到0.86U/mL,相对于出发菌株提高了2.4倍。对影响突变菌株G-17摇瓶液态发酵条件进行了研究,确定发酵的最佳条件为:培养基初始pH为7.0,100μg/L CaCl2,接种量10%(V/V),发酵温度30℃,转速200r/min,摇床震荡培养48h;最佳发酵条件下,发酵液中转谷氨酰胺酶活力达到1.27U/mL。

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶活力调节的研究

对不同氮源生长条件下林肯链霉菌无细胞粗提液中谷氨酰胺合成酶 (GS)的研究结果表明 ,高浓度NH+4阻遏了GS的生物合成。从不同氮源生长条件下林肯链霉菌中分离纯化了GS ,其性质没有差别。以受腺苷化调节的产气克雷伯氏菌GS作对照 ,林肯链霉菌GS没有明显的氨休克作用 ,经蛇毒磷酸二酯酶处理后 ,其活力没有变化。这些结果都说明林肯链霉菌GS不存在腺苷化共价修饰这一调节方式。反馈抑制作用是林肯链霉菌GS的一种重要的调节方式 ,这种抑制作用是以累积的方式进行的 ,这表明各种抑制剂对GS作用位点不同 ,各种抑制剂对GS的抑制作用是相互独立的。由此推测 ,林肯链霉菌GS是一种变构酶。

加拿大批准来自茂原链霉菌M2020197的转谷氨酰胺酶用于多种食品

2023年3月2日,加拿大卫生部发布NOM/ADM-0196号文件,批准来自茂原链霉菌M2020197的转谷氨酰胺酶(transglutaminase from Streptomyces mobaraensis M2020197)用于多种食品,同时修订允许使用的食品酶清单,自2023年3月2日起生效。在加拿大,另一种来源的谷氨酰胺转氨酶已被允许用于部分食品中,而此前茂原链霉菌M2020197还不是任何食品酶的允许来源。

用筛选抗分解代谢阻遏突变株法选育谷氨酰胺转胺酶的高产菌株

以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCCM203062为出发菌株,采用N离子注入和紫外诱变处理,得到MTG酶活达到7.19U/ml的高产菌株BB-2。对BB-2再进行紫外诱变,选育出具有较好稳定遗传性的抗2-脱氧-D-葡萄糖的高产突变株DG-1,酶活达到9.21U/ml,比出发菌株提高了118.5%。