L-亮氨酰对硝基苯胺的合成

L-亮氨酰对硝基苯胺是多种氨肽酶家族成员活性测试的底物,但其合成工艺鲜有文献报道。经过实验方法研究,以低毒的三光气作为关键试剂,替代文献报道的光气。并在此基础上对反应溶剂、反应温度和三光气的用量等因素进行了考察,优化了反应条件。目标化合物结构通过熔点和核磁共振等手段进行了确证。

甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸盐的合成及临床应用

目的合成甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)的底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸盐,并探讨其临床应用。方法采用DCC-HOB t脱水合成多肽方法制备甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸盐;采用连续检测法测定血清GPDA的活性。结果获得高纯度底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸盐,纯度为98.5%。血清GPDA活性在358.1 U/L以下线性良好,标本批内、批间平均变异系数分别为3.01%、5.04%。应用于临床检测表明,肝癌组GPDA活性增高而胃癌组和慢性胃炎组GPDA活性则下降,与正常组比较均有显著差异(P<0.05,P<0.01)。结论所合成的底物符合临床诊断肝癌、胃癌及慢性胃炎的要求。

连续监测法测定血清亮氨酸氨基肽酶的活性及临床应用

目的应用亮氨酰对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物建立测定血清亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性的连续监测法,并探讨其在肝病诊断中的临床意义。方法基于LAP催化水解Leu-pNA生成有色对硝基苯胺的原理,对pH值、底物浓度、反应时间等条件进行研究,并用该法检测临床各种肝病血清LAP活性。结果酶促反应最适pH为7.20,最适底物浓度为4.8 mmol/L,批内、批间平均变异(CV%)分别为3.68%、5.91%。临床检验表明,肝硬化、活动性肝炎患者的血清LAP活性均高于正常组,呈现显著性差异(P<0.05)。结论本法灵敏度高,结果准确,且操作简便,在肝脏疾病诊断中具有临床意义。

血浆弹性蛋白酶的微量测定和临床应用

目的 拟建立一种血浆弹性蛋白酶的快捷、微量测定方法。方法 以琥珀酰甘氨酰对硝基苯胺 (succinyl-L -trianalinyl-p -nitroanilide ,SLAPN)作为弹性蛋白酶的作用底物 ,根据单位时间内 4-硝基苯胺释放量 (A450nm)的变化 ,反应弹性蛋白酶的活性。结果 线性范围为 0～ 5 0 0 μg/L,批内和批间误差分别为 5 .0 2 %和 8.3 2 % ,血浆用量仅为 2 0～ 40 μl。正常健康人 (n =12 )血浆弹性蛋白酶含量 (3 7.5 0± 15 .5 6)μg/L。肠瘘合并感染患者 (n =6)为 (4 8.40± 2 7.82 )μg/L,明显高于正常人 (P <0 .0 1)。猪急性出血坏死性胰腺炎 (5 %牛磺胆酸钠 + 80 0 0～ 10 0 0 0u/ml胰蛋白酶 )诱导12h后为 (2 3 9.0 6± 180 .2 4) μg/L明显高于诱导前水平〔(3 6.15± 9.40 ) μg/L,P <0 .0 1〕。结论 该方法操作简便、快捷、灵敏度高、特异性好 。

α_1-抗胰蛋白酶活性测定方法及其影响因素的研究

目的研究用发色底物法测定α1-AT生物活性时，以正常人混合血浆为参考标准的血浆稀释度范围和测定的影响因素。方法采用酶标仪测定抗胰蛋白酶与过量的胰蛋白酶反应后，剩余的胰蛋白酶与BAPNA发色反应的OD值（405nm），观察时间和温度对反应的影响，优化正常人混合血浆（30人份）稀释度范围，建立并验证血浆标准曲线，同时观察几种物质对测定的影响。结果通过优化实验．血浆的稀释倍数在1／50～1／100之间有良好的线性；PEG4000、蔗糖、Tween80／TNBP（S／D）、辛酸钠等对活性测定无明显影响，而枸橼酸钠浓度〉0．125mol／L，α1-AT生物活性测定结果偏高约20％。结论以正常人混合血浆为参考标准品，用酶标仪测定α1-AT的生物活性，快速、准确，方法稳定可靠，α1-AT制备过程中常用的几种物质，除枸橼酸钠外，对其活性测定均无影响。

肺炎克雷伯菌氨基肽酶A的克隆表达与活性鉴定

目的对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达,鉴定其酶活特性。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence:NZ_CP045783.1)设计扩增引物,以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长,使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白,使用N^(2+)层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物,测定KP PepA对其水解能力,并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子,观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用t检验。结果扩增出长度为1527 bp的KP PepA基因,并获得可溶性KP PepA蛋白,大小为56.1×103,与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00)μmol/L比(8.00±2.00)μmol/L,t=63.36,P<0.01],表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37℃,最适pH值为pH 8.0。Co^(2+)、Mn^(2+)均可以提高KP PepA酶活性,其中Co^(2+)激活作用最强,加入Co^(2+)组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00,t=16.44,P<0.01);Zn^(2+)、Fe^(2+)均可以抑制KP PepA酶活性,其中Zn^(2+)抑制作用最强,加入Zn^(2+)组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00,t=8.49,P<0.01)。结论肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。