小麦与条锈菌亲和互作的差减文库构建及初步分析

【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST(unigene)。经BlastX比对和功能分类分析,其中50条unigene(33.6%)未找到同源性匹配,25条(16.8%)与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌有较高同源性的基因。随后,进一步利用RT-PCR对6个基因的表达模式进行了分析。【结论】成功构建了小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离出一部分与小麦条锈病发病相关的基因,可用于进一步研究条锈菌侵染过程中特异基因的功能。

小麦与条锈病菌不亲和互作的超微结构

采用条锈菌同一小种的野生型菌系和弱毒突变菌系 ,分别接种同一小麦品种的方法 ,研究了不亲和互作的超微结构特征。在不亲和互作中 ,条锈菌的胞间菌丝、吸器母细胞和吸器明显受抑。吸器可以在发育早期受抑坏死 ,也可迟滞至吸器体形成之后坏死。吸器外质膜严重皱褶 ,并出现孔洞 ,吸器外间质加宽 ,沉积大量电子致密物质。侵染位点的小麦叶肉细胞表现与过敏性坏死反应相关联的一系列变化。

角瓜与南方根结线虫非亲和互作相关MicroRNAs的鉴定

为鉴定角瓜与南方根结线虫非亲和互作中的植物源MicroRNAs(miRNAs),预测miRNAs的靶基因,解析miRNAs的表达模式。构建角瓜与南方根结线虫亲和、非亲和互作的小RNA(sRNA)文库,通过Solexa测序和生物信息学分析筛选鉴定角瓜与南方根结线虫非亲和互作相关的miRNAs,利用PsRNATarget软件预测miRNAs的靶基因,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对测序获得的miRNAs进行表达验证。结果表明,18份样品测序获得的Unique reads数量在808262~3926308条,长度24 nt的sRNA丰度最高,miRNAs占sRNA的0.3%~0.5%,包含565个已知miRNAs,归属75个miRNAs家族,其中miR156包含的家族成员数目最多。26条差异表达的miRNAs响应南方根结线虫胁迫的表达模式分为4种类型,其中10条显著差异表达的角瓜miRNAs与南方根结线虫非亲和互作密切相关。miRNAs靶基因预测显示,一个miRNA可调控多个靶基因,同一miRNA的靶基因同源性较高,miRNAs靶基因功能主要涉及转录激活,参与植物生长发育和调控,以及编码信号传导和细胞代谢相关蛋白等。这些研究结果为探明角瓜与根结线虫非亲和互作的miRNAs调控机理奠定了基础。

大豆与疫霉菌非亲和互作早期差异显示基因的表达分析

大豆疫霉根腐病是大豆的毁灭性病害。为了深入了解大豆对疫霉菌的分子抗病机制,以大豆疫霉菌1号生理小种游动孢子接种抗性品种绥农10的根部及下胚轴,通过反转录差异显示技术分离到疫霉菌侵染0、0.5、1、2和4h后大豆下胚轴和茎部的差异表达基因,其中至少有8个基因与抗病相关。接种后0.5 h开始上调表达的有肉桂酸-4-羟化酶基因、ATP合成酶β亚基基因,以及类花生泛素结合酶基因;接种后1h和2h依次开始上调表达的有尿苷二磷酸-N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖基因和豌豆蓝铜蛋白基因;接种后4 h才上调表达的有TGA型碱性亮氨酸拉链基因、大豆环孢素基因和14-3-3蛋白基因。这8个基因中有1个基因与信号传导有关、4个基因与抗病和防御有关、2个基因与转录调控有关、1个基因与能量代谢有关。研究表明,以上8个基因在疫霉菌游动孢子萌发、侵入大豆和在大豆体内扩展过程中起着重要作用。

烟草与黑胫病菌亲和互作的数字基因表达谱分析

为探讨烟草与黑胫病菌亲和互作在转录水平的分子机制,本研究利用Solexa高通量测序技术分析感病品种红大接菌前0 h和接菌后12 h、24 h、48 h和72 h茎部组织的基因表达谱。将5个时间点样品的Unigene表达量依次进行两两相比,4个时间点分别鉴定出11 434、12 190、5 128、7 428个差异表达基因。GO功能分析表明,已注释的差异表达基因显著富集到细胞组分中的细胞壁、胞外区域和质膜上,分子功能的催化活性、激酶活性、核酸结合转录因子活性和信号转导活性,并主要参与响应刺激、响应胁迫、次级代谢、信号转导等生物学过程。Pathway分析显示,差异表达基因显著富集到多条次生代谢产物生物合成途径和碳水化合物代谢途径,以及与抗病相关的植物与病原菌互作、植物激素信号转导等途径。14类共计36个已知功能差异基因参与植物与病原菌互作Pathway,多数属于PTI途径调控基因,且基因表达量在黑胫病菌侵染中期(48 h)达到最高;仅有4类ETI途径调控基因差异表达,其中抗病负调控因子RIN4在黑胫病侵染前、中期(24 h,48 h)上调表达,信号组分HSP90接菌后24 h下调表达。由此可以推测,受黑胫病菌侵染后,红大品种中PTI途径调控基因能有效响应黑胫病菌胁迫反应,从而提高对黑胫病菌的抵抗能力,而ETI途径调控基因不能有效响应黑胫病菌胁迫反应。本研究初步揭示了烟草黑胫病感病品种在转录水平上的表达差异,为培育优质抗病新品种提供了理论基础。

甜瓜与白粉病菌非亲和互作的数字基因表达谱分析

为探讨甜瓜与白粉病菌非亲和互作在转录水平的分子机制,本研究选用高抗甜瓜品种‘Yuntian930’,利用Solexa高通量测序技术分析甜瓜幼苗接种白粉病菌前0 h和接菌后24 h、48 h和72 h的基因表达谱。与未接种相比,接种后3个时间点分别鉴定出219个、1 784个和2 371个差异表达基因,且上调表达基因数多于下调表达基因数。GO功能分析表明,已注释的差异表达基因显著富集到代谢过程、生物学过程、磷代谢过程、磷酸化及蛋白磷酸化修饰、光合膜、类囊体、氧化还原酶活性和序列特异结合位点等生物学过程。Pathway分析显示,差异表达基因富集到多条物质代谢、次级代谢物合成、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、光和系统、植物激素信号转导等通路中。比较各接种时间的差异表达基因显示,接种后48 h鉴定出的差异基因和Pathway最多,并发现有7个涉及多胺代谢的差异表达基因,其中6个呈上调表达。这一结果进一步验证了多胺代谢途径基因能有效响应白粉病菌胁迫反应,从而提高对白粉病菌的抵抗能力。利用q RT-PCR验证4个多胺代谢相关基因在接种白粉病菌后的差异表达,其结果与DGE一致,证实了DGE测序结果的可靠性。

白叶枯病菌与非亲和水稻IRBB4悬浮细胞互作中蛋白类激发子的纯化和鉴定

本研究对水稻白叶枯病菌与水稻悬浮细胞非亲和互作中蛋白类激发子进行了分离纯化和鉴定。白叶枯病菌JXOⅤ与水稻IRBB4和IR24悬浮细胞互作 36h后的上清液,经Q Sepharose阴离子交换层析柱分离,对分离的各组分进行抗病性诱导测定,结果表明JXOⅤ与IRBB4非亲和互作的上清液中存在蛋白类激发子。有活性的蛋白组分经阴离子交换层析柱Mono Q进一步纯化后,SDS PAGE分析鉴定出 2个具激发活性的蛋白,其分子量分别为 17. 2kD和 49. 2kD,等电点分别为 5. 8和 6. 2。利用上述激发子处理水稻能减少病斑长度并诱导水稻防卫酶活性的增加。

小麦/小麦秆锈菌亲和性互作的组织病理学及超微结构研究

利用化学显微技术和生物电镜技术,系统地研究了小麦秆锈菌在感病寄主上发育过程的组织学及超微结构特征。结果表明:小麦秆锈菌的发育过程可分为几个明显的阶段:孢子萌发和芽管形成,附着胞的形成和气孔下囊的分化,初生侵染菌丝和次生侵染菌丝的形成和生长,吸器母细胞和吸器的形成,夏孢子床和夏孢子堆的产生。小麦秆锈菌菌丝沿着细胞壁生长和蔓延,菌丝顶端细胞原生质稠密,代谢旺盛;吸器母细胞形成在细胞壁周围,吸器产生在细胞里面,呈指状,吸器外围和细胞膜区域有吸器外间质的存在。小麦秆锈菌发育早期,小麦细胞一直保持正常;而在发育后期,小麦细胞发生了质壁分离,叶绿体片层受到破坏。

苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征

从细胞角度揭示苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作机制。以两者亲和性互作系统为研究材料,利用透射电子显微镜技术研究了苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征。结果表明,病菌侵入寄主组织后,菌丝直接穿透寄主细胞壁进入寄主细胞形成胞内菌丝,以胞内生长并向相邻细胞扩展。病菌菌丝穿透寄主细胞壁时,菌丝中的液泡给予了较大的压力帮助其穿透。进入寄主细胞内的病菌菌丝,被内陷的寄主原生质膜包裹,菌丝与质膜始终是隔离的,寄主原生质膜和细胞壁之间沉积电子致密度深的物质。病菌菌丝不断地在寄主原生质膜区域扩展,伴随菌丝体在寄主细胞内的不断扩大,周围的原生质膜也相应扩大其面积,但始终将寄主原生质与菌丝体隔开,而脱离质膜的菌丝形成菌丝鞘包裹。随侵染程度的增加,未被穿透的寄主原生质膜区域逐步被降解。病菌侵染叶绿体等细胞器时,首先是菌丝鞘与叶绿体等细胞器膜相连,然后降解其基粒片层结构,被降解的细胞器组织沿菌丝和胞壁周围沉积。侵染后期,菌丝胞内和胞外扩展,但处在细胞降解物中的菌丝显示较厚的细胞壁,寄主细胞内充满了大量的黑色物质和结晶状的颗粒物。

小麦TaLTP5参与小麦与条锈菌的非亲和互作反应

为明确非特异性脂质转移蛋白基因Ta LTP5在小麦抗条锈性产生过程中的作用,本研究对该基因进行了染色体定位分析,并利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析了其转录表达特征。研究结果显示,小麦Ta LTP5基因定位在小麦3B染色体的短臂上,位于3BS8-0.78-1.00染色体区段;Ta LTP5在小麦与条锈菌的非亲和过程前期表达量显著升高,而在亲和过程中没有明显变化;Ta LTP5的表达受到外源水杨酸(SA)、聚乙二醇(PEG)模拟的干旱和外源脱落酸(ABA)的胁迫强烈诱导,而外源茉莉酸甲酯(Me JA)、乙烯(ET)和低温在一定程度上抑制基因的表达。研究结果表明,在小麦-条锈菌非亲和互作中,Ta LTP5可能是小麦对条锈菌的抗性产生信号转导途径的正调控因子,而且参与了小麦的非生物胁迫应答过程。本研究结果对于调控植物抗性和培育抗病品种均有重要意义。

水稻中MPK5稳态失衡抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作

拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)为水稻的重要土传病原,可严重为害水稻。本研究旨在探究水稻中丝裂原活化蛋白激酶5(MPK5)稳态失衡对拟禾本科根结线虫与水稻亲和互作的影响,并初步探讨其机制。首先,通过线虫侵染试验发现,在水稻中超表达和沉默MPK5引发的MPK5稳态失衡均可抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作。qRT-PCR分析结果显示,与水稻野生型不同,在MPK5超表达和沉默水稻株系中MPK5均受拟禾本科根结线虫诱导表达。同时,拟禾本科根结线虫可抑制MPK5超表达株系中几丁质酶的表达,但诱导MPK5沉默株系中病程相关基因PR5与PR10的表达。上述试验结果表明,MPK5稳态失衡可导致MPK5响应拟禾本科根结线虫的侵染,且在MPK5超表达和沉默水稻株系中MPK5介导水稻产生拟禾本科根结线虫抗性的机制不同。

小麦与小麦秆锈菌互作及非亲和机制研究

小麦与小麦秆锈菌互作及非亲和机制研究ＳＴＵＤＩＥＳＯＮＴＨＥＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳＯＦＩＮＣＯＭＰＡＴＩＢＩＬＩＴＩＥＳＢＥＴＷＥＥＮＷＨＥＡＴＡＮＤＰＵＣＣＩＮＩＡＧＲＡＭＩＮＩＳＦ．ＳＰ．ＴＲＩＴＩＣＩ贾显禄（沈阳农...

水杨酸和茉莉酸/乙烯信号通路关键基因在月季-黑斑病菌互作中的表达模式

【目的】监测月季水杨酸和茉莉酸信号途径关键基因的表达动态,以阐明水杨酸、茉莉酸/乙烯抗病信号途径在月季响应黑斑病菌过程中调控机制。【方法】以与黑斑病菌(cfcc87205)呈亲和互作的月季‘粉和平’离体叶片为材料,设置无菌水诱导2 h接种(CK+IN)、2 mmol·L-1SA诱导2 h不接种(SA+NO)、2 mmol·L-1SA诱导2 h接种(SA+IN)、0.2 mmol·L-1MeJA诱导2 h不接种(JA+NO)和0.2 mmol·L-1MeJA诱导2 h接种(JA+IN)5个处理和空白对照组(CK),在接种后16~144 h取样并通过RT-qPCR技术监测水杨酸信号途径ICS、NPR1、PR1和茉莉酸信号途径相关基因AOS、JAR1、COI1、MYC2共7个基因的表达动态,对不同处理下各基因在同一时间点的表达量差异和同一处理下各基因的表达动态进行综合分析。【结果】1)CK+IN处理中,ICS下调表达,NPR1在16 h上调、在48~144 h持续下调表达(P<0.05),PR1和JAR1除分别在48和16 h下调表达外其余时间点与CK处理无显著差异(P<0.05),AOS在16 h上调表达、72 h下调表达、在24、48和144 h与CK处理无显著差异(P<0.05),COI1在24~72 h上调表达(P<0.05),MYC2在16 h上调表达、在48 h与CK处理无显著差异、在24、72和144 h下调表达(P<0.05);2)SA+IN处理中,ICS、NPR1、PR1和AOS上调表达(P<0.05),JAR1与CK+IN处理中无显著差异(P<0.05),COI1下调表达(P<0.05),MYC2除在接种16和48 h与CK+IN处理中无显著差异外其余时间点上调表达(P<0.05);3)JA+IN处理中,ICS在16 h下调表达、在24~144 h上调表达(P<0.05),PR1在16、72和144 h上调表达、在24和48 h与CK+IN处理无显著差异(P<0.05),AOS和MYC2上调表达且在48 h前上调幅度较大(P<0.05),JAR1除在24 h上调表达外、其余时间点与其在CK+IN处理中无显著差异(P<0.05),NPR1和COI1变化趋势同SA+IN处理。结果表明,病原菌对水杨酸和活性茉莉酸的合成有抑制作用,SA+IN处理可提高水杨酸信号途径相关基因的表达、促进茉莉酸的生成、但对活性茉莉酸的合成影响不大,接种48 h前SA+IN处理可削弱病原菌对MYC2的诱导效应,接种48 h后SA+IN处理在提高ICS和PR1表达的同时也可提高MYC2的表达;JA+IN处理在促进活性茉莉酸合成和PR1表达的同时,也提高MYC2的表达。4)在SA+NO和JA+NO处理中,7个基因的表达量相对于CK不同程度的发生改变,但其变化趋势与相应的SA+IN和JA+IN处理不一致,说明病原菌影响外源水杨酸和茉莉酸对寄主相应信号通路基因的诱导表达。【结论】黑斑病菌对月季的水杨酸和茉莉酸/乙烯信号途径有抑制作用,且在接种48 h前主要抑制水杨酸信号途径、在接种48 h后主要抑制茉莉酸/乙烯信号途径。病原菌可能通过操纵月季MYC2的上调表达来实现其对水杨酸和茉莉酸/乙烯信号途径的双重抑制。

烟草与TMV不同互作中PAL活性变化

漂盘培育云烟87和三生烟,苗期接种TMV后0h,12h,24h,36h,48h,60h和72h分别取样测定其叶片和根系中PAL的活性,并以未接种TMV烟苗叶片和根系中PAL的活性为对照.结果表明:烟草与TMV非亲和性互作时,叶片和根系中PAL活性上升速度比烟草与TMV亲和性互作时PAL活性上升速度快;烟草与TMV无论是亲和性互作还是非亲和性互作,烟草叶片中PAL活性升高速度快于根系中PAL活性上升速度.

细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用

细胞色素P4 5 0是广泛存在植物体中的一种多功能氧化酶 ,它在植物对病原侵袭的防御反应中起着重要的作用。本文从植物P4 5 0的多样性 ,及在寄主 病原物不亲和互作中的特异表达 ,证明了P4 5 0参与植物的抗病反应 ;同时 ,分析P4 5 0在植物抗病反应的作用途径 ,说明P4 5 0在植物抗病基因工程中存在巨大的应用潜力。

黑胫病菌诱导的烟草SSH文库构建及其分析

黑胫病是危害严重的世界性烟草主要病害之一,探究烟草对黑胫病的抗病机制,可以为该病的综合防治提供理论依据。本研究以烟草黑胫病抗性品种革新3号为材料,利用黑胫病0号生理小种诱导其水平抗性,分别在接种后0.5、1、3、6、10和16d取样,通过抑制差减杂交技术(SSH)构建cDNA文库,获得了960个阳性克隆。利用反向Northern斑点杂交技术对其中240个阳性克隆进行杂交筛选,筛选出57个表达差异明显的基因,序列拼接后获得33条高质量EST,测序及其比对分析表明,革新3号对烟草黑胫病抗性相关基因主要涉及抗病防卫、光合作用、信号传导和能量代谢等方面。进一步基因功能分析显示,病程相关PR1b蛋白、半胱氨酸蛋白、延伸因子1-α、α-微管蛋白、细胞色素P450、精胺合成酶、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、甘氨酸延伸因子等可能参与了烟草与黑胫病菌非亲和互作过程。

疫霉蛋白激发子PB90对病原菌生长与致病力的影响

激发子PB90是由棉疫病菌分泌的可诱发非寄主植物系统获得抗病性的一类新型蛋白激发子。本文就该激发子在棉疫病菌生长发育及致病过程中的作用进行了研究。采用胶体金标记发现该激发子主要分布在棉疫病菌的细胞壁上,该激发子可以分泌到细胞外;在离体条件下,PB90的多克隆抗体并不抑制棉疫病菌游动孢子的萌发和孢子萌发后形成菌落的能力,而且抗体包埋的游动孢子仍能激发非寄主植物烟草的过敏性坏死反应;但是,抗体的包埋处理可以使棉疫病菌的游动孢子丧失对棉花的致病力。结果表明,特异性存在于细胞壁上的疫霉蛋白激发子PB90是棉疫病菌的一种重要的毒性因子,在病菌对棉花的致病过程中具有重要作用;此外本研究结果还提示PB90并不是惟一能诱导非寄主烟草过敏性反应的棉疫病菌激发子,除了PB90之外,棉疫病菌还能产生其它的激发子诱导烟草的过敏性坏死反应。

水稻对不同小种稻瘟菌抗性差异表达基因的鉴定

以同一水稻品种接种不同小种稻瘟菌,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建水稻-稻瘟菌非亲和/亲和互作消减cDNA文库。经差异筛选、序列分析及RT-PCR验证,共获得25个独立的差异表达cDNA克隆。根据与它们同源基因的功能推测,这些cDNA克隆可能参与了对病原菌的防卫反应、转录和蛋白合成与修饰等一些重要的生物学过程。通过RT-PCR检测了差异表达基因在非亲和/亲和互作早期的表达谱,所有被检测基因在非亲和/亲和互作零点的表达水平均相同,而在接种后的其他时间点,它们的表达在互作反应中或被诱导或被抑制,说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关,肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。受不同小种病原菌侵染后,由于一些参与防卫反应的基因被诱导或被抑制的程度和持续时间的不同可能导致水稻小种特异的抗性。

过氧化氢诱导水稻细胞过敏反应的研究

本文报道了过氧化氢(H2O2)诱导水稻细胞过敏反应(HR)的剂量和时间作用效应。由葡萄糖/葡萄糖氧化酶组成 的H2O2发生体系能稳定持续产生H2O2,有效地诱导HR;然而,直接添加的H2O2则被水稻细胞快速降解,不能有效地诱导 HR。利用添加过氧化氢酶清除H2O2发生体系产生的H2O2,控制H2O2对水稻细胞作用时间的方法,揭示H2O2诱导水稻细 胞HR存在时间作用效应。此外,H2O2也是水稻与病原细菌不亲和互作中诱导HR的信号组分之一。

甘蔗叶片响应褐锈病菌(Puccinia melanocephala)侵染的转录组分析

旨在从转录水平分析甘蔗叶片响应褐锈病菌侵染的基因表达特征,为进一步研究甘蔗抗褐锈病的分子机理提供基础资料。本研究采用高通量测序技术Illumina Hiseq 2500对健康以及被褐锈病菌侵染的甘蔗叶片进行转录组测序,利用生物信息学方法对差异表达基因进行功能注释和分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对5个差异基因的相对表达量进行了验证。转录组数据分析共鉴定出差异表达基因4716个,其中上调表达2979个,下调表达1737个。GO注释结果显示,差异表达基因主要聚集在细胞过程、生物过程、催化活性等生理生化过程。KEGG富集分析发现,1919个差异表达基因被注释到114个通路中,其中苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢等植物抵御生物胁迫有关的代谢途径的相关基因显著上调表达。qRT-PCR验证5个上调表达基因结果与转录组测序结果的表达趋势一致。