固定化金属亲和层析胶与亲和层析膜纯化rhMn-SOD和rhCu,Zn-SOD的比较研究

为比较固定化金属亲和层析膜与亲和层析胶的纯化效果,分别用固定化金属亲和层析胶Cu2+柱、Ni2+柱、固定化金属亲和层析膜Cu2+柱、Ni2+柱分离纯化rhCu,Zn-SOD、rhMn-SOD/24a、rhMn-SOD/28。结果表明,亲和胶与亲和膜分离SOD获得相似的纯化效果,纯化倍数均在3到5之间,亲和膜分离所得SOD比活略高于亲和胶,rhCu,Zn-SOD与Cu2+的亲和能力高于rhMn-SOD。固定化金属亲和层析膜色谱为基因工程产物的快速分离鉴定提供了一个简便的方法。

固定化镍离子亲和层析胶的制备及其性能鉴定

以Sepharose 6B为原料 ,在强碱性条件下用环氧氯丙烷活化 ,再与亚氨基二乙酸 (IDA)的钠盐溶液反应 ,在活化好的胶颗粒表面接上很多手臂IDA ;最后与硫酸镍溶液反应 ,使手臂IDA与Ni2 +发生螯合反应 ,即得到固定化Ni2 +亲和层析胶 (Ni2 + IDA) .采用原子吸收法及从大肠杆菌表达产物中纯化重组人B淋巴细胞刺激因子 (hBLyS)等方法检测制备胶的理化指标和纯化蛋白质的性能 .结果表明用此法制得的亲和胶与相应商品胶的性能完全一致 ,而成本却不到商品胶的十分之一 .

球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质

球孢白僵菌Beauveria bassiana 1316-V1的培养上清液经硫酸铵分级沉淀，SephadexG-75凝胶过滤，Chitosan-bead亲和层析，第二次SephadexG-75凝胶过滤，得到电泳纯的一种胞外壳聚糖酶，比活力达到45u/mg。此酶的分子量为36kD；最适酶反应温度为60℃；最适pH为4.0；最适离子强度为0.25mol/LNaCl;37℃以下，pH2.0-5.0之间稳定性好；Cu^2+,Hg^2+,Pb^2+,Ni^2+对该酶有强烈抑制作用；Ag^+,Mn^2+也有较强抑制作用；Fe^2+有轻微激活作用，该壳聚糖酶是一种糖蛋白，含糖约为12.6%。酶的最适底物为脱乙酰度为90%的胶体壳聚糖；也能轻微水解CMC、DEAE-Cellulose和胶体几丁质；但不能水解片状的壳聚糖和几丁质。

人心肌肌钙蛋白I的原核表达与纯化

目的构建人心肌肌钙蛋白I(human cardiac troponin I,hcTnI)原核表达载体并表达、分离纯化重组蛋白。方法RT-PCR从人心肌组织中克隆出hcTnI的cDNA序列构建到原核表达载体pQE30,获得重组表达质粒pQE30-hcTnI,并在大肠杆菌M15中诱导表达。镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,Western Blot杂交鉴定重组蛋白。结果经测序证实,获得的目的基因与(GeneBank M64247)公布的hcTnI基因序列一致。pQE30-hcTnI在大肠杆菌M15中经IPTG诱导后表达出相对分子量约为29 kD的目的蛋白,镍柱纯化后经抗hcTnI单克隆抗体进行Western印记,在相对分子量约29kD处可见特异性着色带。结论体外成功诱导了重组hcTnI蛋白表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的hcTnI蛋白,为进一步获得hcTnI的抗体及建立相应的临床快速检测方法奠定了实验基础。

酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定

目的 :从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)并鉴定生物活性。方法 :根据DenisGOSPODAROW ICZ的方法 ,新鲜牛脑匀浆 ,三步硫酸铵盐析 ,最后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖凝胶亲和层析。促 3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性。结果 :用 1.0mol/LNaCl的缓冲液洗脱得到分子量为 136 0 0的多肽 ,得率为 6 10 μg/kg牛脑。氨基酸组成分析与已知的aFGF相同。促 3T3细胞DNA合成的最低浓度为 0 .5ng/ml,最大效应浓度 5 0ng/ml,ED50 值为 8ng/ml。结论