ELISA方法用于McAb亲和常数的测定

以肾综合征出血热病毒(HFRSV)人McAb的检测为模型,建立了测定McAb亲和常数的简易方法。其基本原理是在两种不同浓度抗原包被的微板上进行系列稀释的抗体测定,然后比较由此获得的两条S形反应曲线的OD50(50％最大OD值),代入方程式便可得出亲和常数K值。该法简便、迅速、可靠,是筛选、测定B细胞杂交瘤产物的理想方法。

亲和毛细管电泳间接紫外检测法测定金属络合物的亲和常数

采用亲和毛细管电泳间接紫外检测方法 ,根据“峰漂移”模型 ,通过迁移时间的测定 ,可以获得在水体系中有极低亲和常数的金属络合物的亲和常数。将该方法分别应用于镁离子 柠檬酸体系和锰离子 酒石酸体系 ,在 pH为 5 .0 1,运行电压为 2 0kV ,缓冲溶液组成为咪唑和醋酸的条件下 ,测定了缓冲溶液中加入不同浓度配体后金属离子迁移时间的变化 ,经过数据处理后得出它们的亲和常数对数值分别是 3.2 7和 2 .2 8,与文献值较为一致。该方法适用于结合比为

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2+螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

压电免疫传感器用于人胸苷激酶及其与单克隆抗体反应亲和常数的测定

目的用自制单克隆抗体构建人胸苷激酶(hTK)压电免疫传感器,测定免疫反应亲和常数,评价抗体的活性。方法在压电石英晶体的金电极上自组装一层蛋白A,定向固定hTK单克隆抗体,测定不同浓度hTK引起的频移值。结果根据Scatchard绘图法,对免疫反应亲和常数进行了估算,为1.85×106mol/L。结论该压电免疫传感器可直接测定溶液中的hTK,得到免疫反应的亲和常数,并证实实验室制备的单克隆抗体具有较高活性。

抗rHu-IFN-αMcAb亲和常数的测定

采用ELISA间接法检测抗原－抗体反应系统中游离抗体量的方法，对本实验室制备的5系抗rHu－IFN－αMcAb进行了亲和力测定，获得比较准确的McAb亲和常数。

人源化单抗813-F(ab)_2与人、猕猴、毕格犬血小板反应亲和常数的测定

目的测定人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)单克隆抗体813F(ab)2片段[813-F(ab)2]与人、猕猴、毕格犬血小板结合的亲和常数。方法将人、猕猴和毕格犬的血小板分别包板,生物素标记813-F(ab)2,竞争性ELISA法测定结合到包被血小板上的813-F(ab)2的结合量,Scatchard分析计算出813-F(ab)2与不同种属血小板结合的亲和常数。结果813-F(ab)2与人、猕猴和毕格犬的血小板结合的亲和常数分别为(3.21±3.04)×108L/mol、(1.51±1.39)×107L/mol和(3.62±2.16)×107L/mol,其亲和力由大到小依次为人、毕格犬、猕猴。结论813-F(ab)2与人、猕猴和毕格犬的血小板均有较强的特异性结合能力,为813-F(ab)2的后续药效学评价、毒理分析等提供了基础。

应用曲线拟合方法求解单克隆抗体亲和常数中OD_(100)

目的采用曲线拟合方案测定单克隆抗体亲和常数计算中的OD100。方法以测定抗苏丹红-1单克隆抗体亲和常数为例,非竞争ELISA法测定OD值,经曲线回归拟合结合反应的曲线模型及其方程,依据方程计算OD100值。结果根据幂曲线模型计算的抗苏丹红-1单抗亲和常数为K=8.19×108l/mol。结论应用统计学分析方法拟合的曲线模型,科学可靠地测定了OD100,为单克隆抗体亲和常数的计算提供了科学、合理的测量基础。

重组FLAG标签的融合表达纯化及亲和常数的测定

构建了三种融合标签FLAG1(DYKDDDDK)、FLAG2(DYKDYKYK)和FLAG3(DYKGGGYK)的原核表达质粒pGEX-2t-His-NSH2-FLAG,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,表达并纯化重组蛋白GST-His-NSH2-FLAG。生物信息学分析表明FLAG1的亲水性和抗原性较强,FLAG2次之,FLAG3最弱。Western blotting分析表明单抗M2能够识别此三种FLAG融合蛋白。非竞争性酶免疫法测得FLAG1、FLAG2和FLAG3结合单抗M2的亲和常数分别为0.077μM,0.102μM和0.126μM。相关工作为在多肽芯片上应用FLAG标签进行蛋白质相互作用的检测奠定了一定的基础。

三种FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定

FLAG融合标签是由8个氨基酸组成的短肽,可用于重组蛋白的免疫吸附纯化。为了建立一个基于FLAG融合标签的共表达纯化体系,将2个新的FLAG标签序列DYKDYKDYK和DYKDEDDK与FLAG标签的原有序列DYKDDDDK分别命名为FLAG1、FLAG2和FLAG3,利用PCR将FLAG标签融合到SHP2酪氨酸磷酸酶NSH2结构域序列的C端,并将其重组到原核表达载体pGEX-2T中,并在大肠杆菌中进行表达。利用GST亲和层析柱和分子筛层析柱纯化融合蛋白,Western blotting法检测其免疫活性。免疫印迹结果表明,3个FLAG融合标签都可以被抗-FLAG单克隆抗体M2(AFM2)特异性识别。利用ELISA技术测定3个FLAG标签与AFM2的亲和常数(1/Kd),其Kd值分别为0.143 80、.128 1、0.080 1μmol/L。

饱和分析法测定单抗亲和常数变化的探讨

饱和分析法测定单抗亲和常数变化的探讨李培勇ＤｅｌＶｅｃｃｈｉｏ，Ｓ上海第二医科大学附属瑞金医院核医学科（上海·２０００２５）单抗经放射性同位素标记或与生物剂偶联，较多用于肿瘤定向治疗中。在选择单抗时，除了特异性外，另一值得注重的是抗体的亲和常数，它反...

废水生物处理中基质亲和性常数的测定方法探讨

介绍了废水生物处理中基质亲和性常数(Ks值)的测定方法:间歇进水法、连续流恒化器法、无限稀释法和间歇进水改进法,并对这4种方法的测定原理、方法以及优缺点进行了比较,讨论了各自的适用范围。分别采用4种方法对生物处理含酚废水的Ks值进行了测定。结果表明:经过长期驯化的活性污泥具有较好的苯酚亲和性,其Ks值约为0.06mg/L。间歇进水法不适用于测定低Ks值的情况,连续进水法的测定时间较长,对于混合培养体系也不适用,无限稀释法和间歇进水改进法均能快速准确地测定Ks值,后者操作更为简便。

钙调素与细胞膜上Ca^（2＋）－ATP_（ase）结合域之间亲和性常数的测算

钙调素（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）是一种多功能的酶调节物。Ｃａ２＋－ＣａＭ复合物可激活Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ，并触发Ｃａ２＋从细胞内移出或进入肌浆网内，以维持细胞内钙的平衡。Ｃａ２＋－ＣａＭ与Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ之间的相互作用可用亲和性常数来衡量。本文应用ＢＣＡ方法测定钙调素的浓度，应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳技术测定钙调素的分子量，再用钙调素滴定ＤＣ２０Ｗ，同时测定相应的荧光，从而决定出两者相互作用的亲和性常数。

以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究

目的在Friguent方法基础上建立更加稳定可靠的基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法。方法以抗体对抗原进行竞争结合,通过双抗体夹心法检测在一定抗体浓度竞争下抗原的结合率计算Kd值。结果用改良方法在两次不同条件下检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:2.61×10-12mol/L和2.39×10-12mol/L,而使用Friguent方法在两次不同条件检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:5.57×10-10mol/L和1.41×10-10mol/L。结论相对于Friguent方法,本研究计算出的Kd值更能反映抗原/抗体结合的真实情况,而且在不同实验条件下检测结果重现性强。

用竞争结合分析法测^(125)I-BAC5的亲和力常数Ka值

放射性核素标记单克隆抗体(McAb)的临床应用愈来愈受人重视。核素标记抗体在应用前有许多质量参数应该确定,其中抗体的亲和力常数Ka值就是一项重要指标。我们用竞争结合法测定Mcab的Ka值,取得满意结果,现报告如下。 材料和方法 一、材料: (一)抗低分化鼻咽癌单克隆抗体BAC5:复苏抗低分化鼻咽癌杂交瘤细胞株BAC5,培养至对数生长期,以3.5×10~5个细胞/0.5ml注入6～8周龄BALB/c经产母鼠腹腔,10～14天处死小鼠取腹水经硫酸铵粗提后,再经DEAE-Sepharose 6B柱层析进一步纯化,所获单抗BAC5的纯度为93％,属IgG2a亚类,用直线外推细胞结合分析法测免疫活性分数为86.8％。 (二)无截体(125)~Ⅰ(-Na^(125)Ⅰ):北京原子能研究院提供,用Iodogen法标记BAC5,(125)~Ⅰ标记率为88.6％。标记BAC5的放化纯度92.8％,比活度83MBq/mg,比浓度33.2MBq/ml。 (三)靶细胞为低分化鼻咽癌上皮细胞CNE-2,复苏后在5％CO_2培养箱培养至对数生长期使用。

哈维氏弧菌适配子的SELEX筛选及其亲和特异性研究

哈维氏弧菌是水产养殖中的重要条件致病菌,对其进行快速、准确地检测和鉴定是相关病害防治的基础和关键.适配子具有亲和力高、特异性强、稳定性好等优点,在微生物的检测和鉴定方面呈现出广泛的应用前景.本研究以哈维氏弧菌为靶目标,采用SELEX技术,即指数级富集配体的系统进化技术,筛选其特异性适配子.经15轮筛选后,随机ssDNA文库的亲和力从3.51上升到58.95,提高了15.8倍.筛选出的适配子富集库经克隆、测序后得到52条不同序列,根据同源性将这些序列分成8个家族,其中第1和第2家族的适配子数量最多,超过总数的50%.通过深入分析,筛选出6个对哈维氏弧菌有显著亲和特异性(P<0.01)的高频适配子,其中5个高频适配子(S1、S25、S26、S27、S35)对哈维氏弧菌有较高的亲和力,相应的亲和常数Kd值分别为(32.6±7.1)、(45.3±10.1)、(24.7±5.8)、(34.8±5.6)、(12.9±4.0)nmol/L.本文还对高频适配子的产生机制及其应用价值进行了探讨.本文首次筛选出了对哈维氏弧菌具有较高亲和特异性的适配子,为后续利用适配子进行哈维氏弧菌的检测和鉴定奠定了基础.

维生素C稳定性及其与牛血清白蛋白亲和作用的研究

采用亲和毛细管电泳法对维生素C(VC)和牛血清白蛋白(BSA)亲和作用进行了研究。测得VC和BSA的亲和常数为2.94×103L/mol。同时对VC在水、40mmol/L NaCl、40 mmol/L磷酸盐和5%葡萄糖溶液中的稳定性进行了研究。最后计算得到了在溶液中分解的反应速率常数及活化能数据。

重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体SO57、SOJB对狂犬病毒G蛋白亲和力的比较研究

It is desirable to develop potent rabies virus neutralizing human monoclonal antibodies(McAbs) to replace human or equine polyclonal immunoglobulin in the rabies virus postexposure treatment.Using BIAcore2000,affinity constants of McAbs with rabies virus glycoprotein(G protein) were determined taking human immunoglobulin as control,and affinity constants were calculated using BIAevaluation software.The affinity of McAb SOJB with rabies virus G protein was higher than that of SO57.Competition binding analyses ran on BIAcore2000 revealed that SO57 and SOJB competed for binding to rabies virus G protein,suggesting that epitopes recognized by SO57 and SOJB overlapped.Furthermore,the neutralizing potency of SO57 was significantly greater than that of SOJB as RFFIT showed.So it is desirable to develop SO57 firstly for rabies virus postexposure treatment.

基于生物膜干涉技术检测PDL1抗体与PDL1抗原的亲和力

生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术可对抗体与抗原的相互作用进行亲和力、动力学的全面分析。在抗体克隆筛选、动力学常数测定中对链霉亲和素(streptavidin,SA)生物传感器的需求量较大,但目前鲜有关于SA传感器重复利用的报道。基于BLI技术、再生SA生物传感器建立一种使用再生后的传感器检测PDL1抗体与PDL1抗原亲和力的方法。通过将生物素化的PDL1抗原偶联至SA生物传感器上,再与单链抗体、双价单链抗体、完整抗体和双特异性抗体这4类PDL1抗体结合,计算抗原抗体的亲和力常数,利用甘氨酸(10 mmol·L^(-1),pH 1.7)再生SA传感器,再次进行分子间相互作用力分析。结果显示,重复性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均值为6.87%,批间重复性RSD为0.82%,稳定性RSD均值为6.13%,说明运用甘氨酸再生后的SA生物传感器测分子间的亲和力数据可靠、重现性好、稳定性高,再生后的传感器可继续用于本样品的实时、无标记的抗原抗体相互作用力分析。BLI技术可节省检测成本,为SA传感器的重复利用提供理论依据。

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)核酸适配体的SELEX筛选

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼内脏白点病的主要致病菌。核酸适配体,因其亲和力高、特异性好等多个优点,在微生物检测等多个领域都有较好的应用前景。以变形假单胞菌为靶目标,采用SELEX筛选方法,从高频序列中筛选获得了变形假单胞菌的5个核酸适配体,测定了这些核酸适配体对变形假单胞菌的亲和特异性及其亲和常数(K_(d))和最大亲和力(A_(m)),并对其二级结构进行了分析研究。结果表明,这5个核酸适配体对变形假单胞菌的亲和力是其他非目标菌(嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌)的10倍以上,体现出了较好的亲和特异性。测定了5个核酸适配体(#1、#2、#3、#4、#5)的K_(d)和A_(m),相应的K_(d)值分别为(25.77±6.11)、(7.14±1.86)、(19.59±3.01)、(83.22±22.45)、(34.31±8.76) nmol/L,A_(m)值分别为(789.23±38.46)、(1392.27±58.03)、(3012.50±106.19)、(1457.99±171.32)、(1070.91±70.16) nmol/L。二级结构模拟发现核酸适配体对靶标的结合能力可能主要与其二级结构中的大中型环有关。相关研究对于变形假单胞菌的快速检测及其病害防控都具有重要意义。

抗氯霉素单克隆抗体的制备、纯化及其特异性鉴定

目的:获得能稳定分泌高亲和力抗体的抗氯霉素杂交瘤细胞。方法:重氮化法偶联制备氯霉素(CAP)的免疫抗原和检测抗原(CAP-BSA和CAP-OVA)。应用常规技术融合,三次有限稀释克隆和间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞株,并鉴定抗体特异性。结果:得到一株能够稳定分泌高亲和力,特异性强抗体的杂交瘤细胞株4B12,辛酸-硫酸铵法纯化体内诱生法制备的腹水;纯化后的抗体效价>1:256000,杂交瘤细胞染色体平均数为50±2,分泌的抗体属于IgG1亚类,相对分子质量为157.92ku,亲和常数为8.26×108M-1;与甲砜霉素、庆大霉素、泰乐菌素、青霉素、链霉素和卡那霉素无交叉反应。结论:该细胞株可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求。