基于间接竞争原理的流式微球技术快速检测麦芽中赭曲霉毒素A

建立了一种快速、灵敏检测中药麦芽中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)含量的间接竞争流式微球方法。麦芽样品经60%甲醇/PBS提取,加入20%甲醇/PBS溶液稀释5倍后,离心取上清液制备样品。在编码荧光微球上偶联牛血清白蛋白-OTA(BSA-OTA)复合物,与样品中OTA竞争结合抗OTA特异性抗体,然后加入FITC-IgG孵育,离心洗涤后,用流式细胞仪检测微球表面的平均荧光强度,实现样品中OTA的准确定性定量测定。本方法检测OTA的半数抑制浓度IC_(50)为1.20 ng/mL,相关系数R^2=0.9892,检出限(IC_(10))为0.12 ng/mL,加样回收率为93.9%~97.4%,RSD<3.6%。16份实际麦芽样品中检测到2个阳性样品,OTA的最高含量为3.83μg/kg,未超出欧盟的OTA限量标准,与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测结果相一致。本方法简单、快速、灵敏、可靠,可拓展用于其它复杂基质中多种真菌毒素的定性与定量检测。

环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

单分散聚苯乙烯微球浓度的快速检测方法

用浊度法分别对13种单分散聚苯乙烯微球悬浊液的浓度进行检测,考察粒径、温度、放置时间对聚苯乙烯微球悬浮液浊度的影响.结果表明：在一定浓度范围内,同一粒径的单分散聚苯乙烯微球悬浮液的质量浓度与浊度存在极其显著的相关性;采用浊度法,依据所得到的浓度与浊度的标准曲线可以快速准确地计算悬浊液的微球浓度,相对标准偏差为1.87％～6.36％,加标回收率为93.1％～110.0％,质量浓度检出限在0.01～3.88 mg/L之间.

禽白血病病毒抗原高敏荧光微球快速定量检测方法的建立

为建立快速定量检测家禽样本中禽白血病病毒抗原的方法,对禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体细胞株2E5和3D5进行复苏、鉴定,通过反应条件优化,建立了禽白血病病毒抗原高敏荧光微球快速检测方法。该方法能够快速定量检测家禽样本中禽白血病病毒,敏感性高、特异性强,对其他家禽病原无交叉反应且具有良好的检测重复性。对采自全国的240份临床家禽样品进行检测,同时用美国IDEXX公司生产的ELISA抗原试剂盒开展比较,结果发现两种方法符合率达93.98%,其中阳性样品符合率为90.83%,阴性样品符合率为95.83%;组内与组间变异系数分别低于10%和15%。本研究建立的禽白血病病毒p27抗原高敏荧光微球快速检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

荧光微球免疫层析法快速检测基围虾中环丙沙星

本研究将环丙沙星单抗与带羧基的荧光微球偶联标记,将环丙沙星抗原和羊抗鸡IgY分别包被于硝酸纤维膜上作为检测线(T)和控制线(C),然后根据其荧光信号比值(T/C)和样本中环丙沙星药物浓度之间的对应关系建立了一种简单快速、高灵敏检测基围虾样本中环丙沙星药物残留的荧光微球定量免疫层析检测方法,检测过程可在15 min内完成。结果表明,在最优条件下,基围虾样本中的环丙沙星检测范围为0~10 ng·mL^(-1),检测限为0.208 ng·mL^(-1),回收率为90.59%~111.70%,变异系数为4.20%~10.76%。特异性实验表明环丙沙星抗体与其他喹诺酮类药物交叉反应率较低。本方法灵敏度高、准确度高、性能稳定、特异性好,可较好地满足现场快速定量检测基围虾样本中环丙沙星药物残留的需要。

荧光纳米微球免疫层析技术检测新型冠状病毒研究

采用碳二亚胺(EDC)法将抗新冠病毒核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体与稀土铕荧光纳米微球共价偶联,合成荧光标记免疫探针,并用透射电子显微镜进行表征。开发了一种检测新型冠状病毒的荧光免疫检测试纸条,通过荧光检测仪测定检测线上的荧光强度,建立了定量检测新冠病毒的荧光免疫检测技术。本研究研制的新冠病毒荧光免疫层析试纸条,与荧光检测仪配套使用,对新冠病毒N蛋白的最低检出限达到0.01 ng/mL;对新冠病毒检测特异性强,与肺炎支原体、禽流感病毒等其它呼吸道肺炎病原物无交叉反应;对新冠灭活病毒的检测,用本研究开发的荧光免疫试纸条技术与荧光定量PCR进行比对验证,灵敏度为荧光定量PCR的1/100;与胶体金抗原检测试纸条相比较,比胶体金试纸条灵敏10倍以上。本研究开发的新冠病毒荧光检测试纸条,操作简便、快速、灵敏、成本低、体积小,适于现场快速检测。

放射性微球技术检测实验性股骨头坏死血流量

为探讨在使用激素过程中如何预防股骨头坏死，本研究在建立激素性股骨头坏死动物模型的过程中，给予相关药物行预防治疗，并采用放射性微球技术测量股骨头血流量，以判断治疗效果。

猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。

重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RPA扩增后用LMTS检测,确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×101 CFU/mL纯菌液;特异性结果表明与沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应,特异性良好;用食物样品评估RPA-LMTS检测效果,结果显示经过增菌3小时后,RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。

快速膜乳化技术制备均一小粒径复合多糖微球及其色谱性能评价

采用快速膜乳化技术制备均一小粒径复合多糖微球,重点探究膜乳化工艺关键参数和微球固化冷却工艺等对微球形貌、粒径及其分布的影响,以及制备工艺对微球耐压性能的影响,在此基础上制备粒径均一、耐压性能良好的小粒径复合多糖微球。色谱研究表明,该均一小粒径复合多糖微球具有较高的色谱分离度,在高分辨率色谱领域具有良好的应用前景。

免疫磁性糊精微球的制备及快速分离检测单增李斯特菌

研究免疫磁性糊精微球的制备及在快速分离检测单增李斯特菌中的应用。将磁性糊精微球由环氧氯丙烷活化后,与抗体交联制得免疫磁性糊精微球,通过单因素和正交试验对合成条件进行优化。再利用合成好的免疫磁性糊精微球捕获单増李斯特菌,在外加磁场的作用下,富集免疫磁性糊精微球,提取细菌DNA,经过PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明:活化反应的最佳条件,环氧氯丙烷用量0.4 mL/g,NaOH浓度2.0 mol/L,最佳反应时间5 h;制备免疫磁性糊精微球的最优合成条件:抗体质量浓度1.0 mg/mL,反应温度28℃,反应时间2.5 h;捕获单增李斯特菌时,免疫磁性糊精微球的最佳用量100μL、最佳捕获时间1 h。通过研究得出免疫磁性糊精微球可以快速捕获单增李斯特菌,并能扩增出特异性产物,检出限达到每mL菌液中10个单增李斯特菌。

荧光免疫层析技术原理及其在病原微生物检测中的研究进展

荧光免疫层析技术是近年来开发的一种新型免疫检测技术,以荧光微球为标记物,既保留了传统胶体金试纸条检测速度快、价格便宜、操作简单、携带方便等优点,又通过荧光技术提高了检测的灵敏度。荧光免疫层析技术对实验设备、资源的要求低,特别适合在条件有限的实验室及野外开展动物疾病快速诊断。本文详细介绍了荧光免疫层析技术的原理及其在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用研究,以期为病原微生物现场快速诊断技术的开发提供参考。

微滴式数字PCR技术在菜豆晕疫病菌检测中的应用

为了建立菜豆晕疫病菌(Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,实现菜豆晕疫病菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控,以菜豆晕疫病菌为研究对象,以位点特异性重组酶作为靶标基因,SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P为特异性引物与探针,建立菜豆晕疫病菌ddPCR反应体系,结果表明,菜豆晕疫病菌的ddPCR检测体系的绝对定量检测低限为0.6 copies/μL,ddPCR的检测灵敏度比常规PCR高2个数量级。同时研究了种子携带菜豆晕疫病菌是否具有活性,提高了疫情检出率。

基于时间分辨荧光纳米微球的伏马毒素B1快速定量检测卡的制备及应用

为了满足粮食谷物中伏马毒素B1快速定量检测的需求,以伏马毒素B1为研究对象,建立了基于时间分辨荧光纳米微球的FB1荧光快速定量检测卡,检测前无需调整样品提取液pH,并借助酶联免疫试剂盒及高效液相色谱法分析比对了该荧光定量快速检测卡在粮食谷物(大米、玉米、小麦)中的检测性能。结果表明其检测不同样品的LOD在35.37~37.17μg/kg之间,LOQ在117.9~123.9μg/kg之间,灵敏度良好;线性范围均为250~6000μg/kg,相关系数R2在0.9972~0.9995之间;不同样品中6个添加水平的加标回收率为83.38%~114.66%,变异系数(CV)小于15%,准确性和重复性良好;国标液相色谱法和伏马毒素B1荧光定量快速检测卡同时检测FB1污染的不同样品,检测结果的符合度为92.53%~106.26%,CV小于10.37%;与其他常见的5种真菌毒素的交叉反应率均小于5%,且添加浓度和检出浓度的差异极显著,表明特异性良好。因此,所制备的FB1荧光定量快速检测卡能够满足粮食谷物中伏马毒素B1现场化快速定量检测的需求。

量子点流式微球技术用于DNA的检测研究

目的构建一种基于新型纳米材料量子点的流式微球技术,用于高通量的DNA检测,实现DNA的快速、低成本检测。方法将能与靶DNA一端杂交的探针DNA(P1)标记在微球表面,与DNA配对杂交后,加入能与靶DNA另一端杂交的量子点标记的探针DNA(P2),组装成一种流式微球-探针P1、靶DNA、量子点-探针P2的夹心复合结构,通过测定杂交前后平均荧光强度的变化检测DNA的浓度。结果该新型检测方法可以区分出完全互补、单碱基错配及完全非互补的DNA(P<0.05),且随着DNA浓度的升高,检测到的平均荧光强度逐渐增强(P<0.05),对DNA的最低检出限可达0.2 nmol/L。结论新型量子点流式微球技术检测DNA具有高敏感性和高特异性、分析速度快、操作简单等优点,是一种非常重要的具有潜力的新型临床检测方法。

氮磷共掺杂碳荧光微球荧光法快速检测5-硝基靛红

以磷酸铵和抗坏血酸钠为前驱体,通过一步水热法合成了水溶性良好的氮、磷共掺杂碳荧光微球(N/PCFMs)。通过透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜图(SEM)、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、X射线光电子能谱等技术对制备的N/P-CFMs进行形貌及光学性质表征。结果表明,N/P-CFMs呈近似球形,尺寸分布在1.09~2.30μm之间;N/P-CFMs表面含有羟基、氨基、羧基及磷酸等官能团,因此其具有较好的水溶性。该N/P-CFMs荧光量子产率为18.9%。基于5-硝基靛红对N/P-CFMs的快速、高选择性猝灭,建立了定量测定水中5-硝基靛红含量的新方法。在最优实验条件下,在0.01~500μmol·L^(-1)范围内,5-硝基靛红的浓度与N/P-CFMs的荧光强度比值(F_(0)/F,F_(0)为N/P-CFMs探针的初始荧光强度,F为加入5-硝基靛红后的荧光强度)呈现良好的线性关系,线性方程是F_(0)/F=0.01246C+0.9958,相关系数(R^(2))是0.9928。检出限为3.5 nmol·L^(-1)。并验证了5-硝基靛红对N/P-CFMs的荧光猝灭机理为内滤效应和静态猝灭效应。将建立的方法用于检测海水中的5-硝基靛红含量,加标回收率为98.6%~102.6%(RSD≤2.0%),所得结果与高效液相色谱法测定结果基本一致,表明本方法具有良好的实用性。

免疫磁性微球快速分离检验金黄色葡萄球菌新技术的研究

目的对采用免疫磁性微球快速分离方法对金黄色葡萄球菌进行检测的方法和效果进行研究分析。方法采用制备得到的金属螯合免疫磁性微球对金黄色葡萄球菌A蛋白进行分离、对免疫印迹进行分析,并对金黄色葡萄球菌进行捕捉、进行灵敏度试验。结果在显微镜下制得的磁性微球的分散状态非常理想,其红外光谱检测结果显示,该类微球的表面存在螯合铜离子和羧基,该微球的结构蛋白为金黄色葡萄球菌A蛋白,可以对金黄色葡萄球菌进行成功捕获,检测的下限可以达到100CFU水平,该微球的活性一般情况下可以维持3个星期作用。结论采用免疫磁性微球快速分离方法对金黄色葡萄球菌进行检测的效果非常理想。

课题名称：重要禁用抗生素分子印迹聚合物微球水相悬浮制备技术及其检测应用

课题内容、目标： 1、建立我国农产品中重要抗生素残留（氯霉素、青霉素、四环素等）MIPMs的水相悬浮聚合技术体系，提出MIPMs对抗生素分子的识别机理。

免疫微球检测技术----用于BCR-ABL融合蛋白的流式细胞测定

本文介绍了BD TM BCR-ABL蛋白分析工具包。它是一种检测白血病细胞溶解液中p190和p210等BCR-ABL蛋白可靠、快速、简单、方便的技术。这种分析方法不依赖于BCR和ABL基因的断裂位置,除了一台流式细胞仪之外,该方法不需要其他专门的实验室仪器,并且可在几小时内得到结果。因而,这种蛋白分析工具包,较传统方法而言,能实现对BCR-ABL阳性样品快速而简单的鉴定。