同位素亲和标签(ICAT)系列技术及其在蛋白质组研究中的应用

近年来 ,大量的研究结果表明双向电泳技术由于不能对分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离 ,因此已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。同位素亲和标签(isotope-codedaffinitytag,ICAT)技术是最近发展起来的一种用于蛋白质分离分析的新技术 ,由于采用了一种全新的化学试剂 -ICAT试剂 ,同时结合了液相色谱和串联质谱 ,因此不但明显弥补了双向电泳技术的上述不足 ,同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速 ,代表着目前蛋白质组分析技术的主要发展方向。最近针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT技术本身又取得了许多有意义的进展 ,已形成ICAT系列技术。

TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用

串联亲和纯化法(TAP)是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术,已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来,随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用,TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲和标签选择,并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。

N末端亲和标签可增进人硫氧还蛋白-1对氧化剂的敏感性

人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1,动物抗氧化能力将增高.近年来,随着人们对氧化还原调控的关注,hTrx1需求不断增加.为了快速获得高纯度重组hTrx1,N末端亲和标签,如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag),被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚.我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒,在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带GST-tag的3种重组hTrx1.纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带,对应的分子量分别为12kD、17kD及38kD.在无氧化剂存在时,它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯.当有H2O2存在时,天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体,对H2O2表现出较强的耐受性;而N末端亲和标签有干扰二聚体形成,使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用,其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag.此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG,有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用,N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用.我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理.

亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。

重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色。亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用。由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异。应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签。近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法。多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述。

亲和标签调节的(S)-羰基还原酶2催化2-羟基苯乙酮的酶学性质

不同类型的亲和标签会影响酶的催化功能和酶学性质。近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis来源的(S)-羰基还原酶2((S)-carbonyl reductase 2,SCR2)能催化2-羟基苯乙酮。文中在SCR2的N端添加不同类型的亲和标签,在大肠杆菌Escherichiacoli中异源表达并纯化重组蛋白his6-SCR2、strep-SCR2和MBP-SCR2,研究了重组蛋白催化2-羟基苯乙酮的酶学性质。结果表明,不同类型的亲和标签对SCR2的酶学性质有一定的影响。其中,不同类型的亲和标签对重组蛋白稳定性影响较大:1)在pH6.0、30℃条件下保温13h后,重组蛋白his6-SCR2和strep-SCR2的剩余酶活力是无融合标签SCR2的90.0%-95.2%,而MBP-SCR2的剩余酶活力是无融合标签SCR2的1.25倍。2)MBP-SCR2在50℃的半衰期比strep-SCR2、his6-SCR2和无融合标签SCR2长26.6%–48.8%。3)MBP-SCR2在-80℃存储60d后,其酶活动力学参数kcat比his6-SCR2、strep-SCR2和无融合标签SCR2高1.25–1.45倍。根据三级结构分析推出重组蛋白MBP-SCR2中MBP的C末端的α螺旋具有稳定SCR2的N端无规则卷曲的作用,从而提高酶的稳定性。圆二色谱检测结果表明MBP标签对蛋白SCR2的二级结构有一定的影响,且解折叠温度(T_(m))分析证明,MBP-SCR2的T_(m)比无融合标签SCR2提高近5℃。研究结果不仅为羰基还原酶家族增添了一种2-羟基苯乙酮的稳定高效催化剂MBP-SCR2,同时为其他短链醇脱氢酶的标签设计提供了借鉴和依据。

将串联亲和纯化标签敲入耻垢分枝杆菌基因组的方法研究(英文)

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将串取亲和纯化(TAP)标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5’端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3’端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果 PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽(PS)亲和标签(PStag)和葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白(IgG)-Fc结合区(ZZ)融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印试验(Western blot)鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验(ELISA)验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。

亲和标记-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于蛋白质相对定量方法的研究

将亲和标记技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱联用,建立了蛋白质相对定量方法,以牛血清白蛋白为实验对象,考察了该方法的准确度、重现性等指标;又以数种标准蛋白混合物为研究对象,考察了该方法的动态范围及相应的标准偏差,为实际生物样品中差异蛋白质分析奠定了基础。

利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

链霉亲和素及其亲和系统的蛋白质进化

链霉亲和素/生物素(Streptavidin/Biotin)体系作为目前已知的最高亲和力作用体系,已在生物学研究中获得广泛应用。本文针对Streptavidin/Biotin和Strep-Tactin/Strep-tag两个相关系统的演化,分别从链霉亲和素蛋白的结构改造、亲和肽标签优化等方面进行了较为详细的归纳。通过对链霉亲和素蛋白各种突变体的优缺点的比较,有助于实际应用中选择合适的Streptavidin突变体。本文通过对链霉亲和素蛋白质进化的综述,可帮助更准确地理解市场上各种链霉亲和素蛋白的功能和用途,并为深入研究链霉亲和素蛋白的进化提供参考。

蛋白质组学技术研究进展

随着现代科学技术的飞速发展,现代生物学技术已经发展到后基因组时代,包括人类在内的几十种生物体基因组测序已经完成,生命科学研究的重点从结构基因组研究转移到后基因组时代——功能基因组的研究,蛋白质组学研究是功能基因组一个重要的组成部分。因此,与之相适应,蛋白质组学研究技术也是日新月异,层出不穷,除了最经典的二维凝胶电泳技术,多维液相色谱技术,同位素标记亲和标签技术相继发展起来,蛋白质芯片技术及噬菌体展示技术也得到了较为广泛的应用。本文针对蛋白质组学研究上述关键技术进行了综述。

蛋白质组学在中药研究中的应用

系统生物学着眼于系统组成成分的构成、动态与发生,与中药对机体的整体而又动态的调节相符合,它的出现给中药研究带来了曙光。作为系统生物学的重要组成部分,蛋白质组学在中药研究中的应用已经越来越多。本文综述了蛋白质组学的常用技术以及近三年来这些技术在中药复方、中药有效部位和中药活性成分等方面的应用。

融合蛋白—— 一种新的生物工程技术

标记亲和多肽片段以其优越性在基因工程中占有重要的地位。介绍了构建融合蛋白的策略 ,优点及其存在的不足。

定量蛋白质组学研究技术

随着蛋白质组研究的深入发展,人们已不满足对一个混合体系中蛋白质进行定性和简单定量分析,要求更加准确的定量分析。为此,有人提出了“定量蛋白质组学”概念。目前,应用于定量蛋白质学的研究技术主要有:蛋白质荧光染色技术、同位素标记技术、同位素亲和标签技术、蛋白质芯片技术。

植物差异蛋白组学研究中几项主要技术的探讨

蛋白质是细胞内的关键物质,是生命活动的体现者.对蛋白质的研究,将有助于阐明生命现象的某些重要机制.目前植物高通量差异蛋白组学技术的发展日新月异,但主要包括双向电泳(2-DE)、双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)、同位素亲和标签(ICAT)、同重同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)4种技术方法.因此,就以上4种技术方法进行探讨,以期更好他利用蛋白组学相关技术.

模式植物蛋白质组研究进展

蛋白质组学是后基因组时代研究的热点,而植物蛋白质组是此研究领域的一块奇葩。这主要归功于模式植物蛋白质组的成就。本文综述了模式植物拟南芥、大豆、水稻、大麦、小麦、玉米蛋白质组的研究进展,并简要介绍了本实验室的工作.最后展望了植物蛋白质组学今后的发展前景。

蛋白质组学研究中的新技术

随着后基因组时代的到来,蛋白质组研究日益受到密切关注。蛋白质组学的发展需要有先进的技术平台作支撑。除了蛋白质组研究中的三大核心技术-双向电泳、质谱和生物信息学技术,近几年又不断涌现出许多新技术。本文对同位素标记亲和标签、酵母双杂交、多维色谱—质谱联用等新技术作一概述。

蛋白质组学研究技术与展望

蛋白质组学是继基因组学之后兴起的一门前沿学科。本文简要介绍蛋白质组学的概念和研究意义,以及蛋白质组学的主要研究技术,并展望蛋白质组学的技术前景。