亲和超滤-液质联用技术筛选补骨脂治疗子宫内膜癌的有效成分

目的采用亲和超滤-液质联用技术筛选补骨脂Psoralea Fructus中治疗子宫内膜癌的潜在活性成分。方法以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor erbB1,EGFR)为靶蛋白,将补骨脂水提液和EGFR蛋白液共同孵育,利用基于亲和超滤原理的超速离心法和解离剂对活性配体进行分离和筛选,借助超高效液相色谱-四级杆飞行质谱技术对与EGFR蛋白亲和的补骨脂化学成分进行鉴定,并通过计算结合变化率比较活性成分与蛋白之间的结合能力。结果共筛选得到4种与EGFR亲和的补骨脂活性成分,通过对结合变化率进行比较,发现psorachalcone A与EGFR蛋白结合变化率最大。结论该研究为补骨脂防治子宫内膜癌的药效物质基础和作用机制研究提供了理论依据。

重组人Tim-3蛋白的制备及基于亲和超滤-液质联用技术的天然配体筛选

目的构建人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)-His表达载体,表达纯化Tim-3重组蛋白,建立亲和超滤-液质联用技术筛选Tim-3蛋白天然配体。方法利用DNA重组技术构建人Tim-3-His表达质粒,转染HEK293细胞表达Tim-3重组蛋白,通过Ni柱亲和色谱柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析Tim-3重组蛋白纯度。10μL受试物(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、白术内酯Ⅰ、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮)溶液、180μL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4,50 mmol·L−1)与10μL Tim-3(0.84 mg·mL^(−1))混合,在37°C黑暗孵育1 h后,转移至1×10^(4)超滤离心管中以12000 r·min^(−1)离心10 min,将沉淀加入200μL甲醇-水(90∶10)中室温解离10 min,12000 r·min^(−1)离心10 min,收集滤液,进行UPLC-MS/MS分析。通过比较受试物组和Tim-3蛋白变性组中超滤液中待测物的峰面积,计算各待测物特异结合率。结果经双酶切及测序鉴定证明,人Tim-3-His重组表达质粒构建正确;纯化的人Tim-3重组蛋白质量分数达90%以上;建立的亲和超滤-液质联用筛选体系专属性、精密度、重复性、稳定性良好;白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。结论成功表达了可溶性、高纯度的人Tim-3重组蛋白,成功建立亲和超滤-液质联用筛选体系,白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。

在线抗氧化分析和超滤亲和液质联用技术快速筛选桂花抗氧化及抑制酪氨酸酶的活性成分

目的:研究桂花水提物的抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性,并初步研究其活性化学成分。方法:以DPPH·清除能力、ABTS^(+)·清除能力和FRAP这3种抗氧化活性评价指标来衡量桂花水提物及其化合物的抗氧化能力;采用超高效液相-ABTS^(+)·-质谱(UPLC-PDA-QDa-ABTS^(+)·)在线法对桂花中的抗氧化活性成分进行定性鉴别,同时采用超滤亲和-液质联用技术(Ultra-filtration affinity-liquid chromatography spectrometry,UF-LC-MS),筛选桂花中的酪氨酸酶抑制剂。用H_(2)O_(2)致皮肤成纤维细胞氧化损伤模型,评价桂花水提物及其化合物对皮肤成纤维细胞的氧化应激保护作用。结果:桂花水提物清除DPPH·及ABTS^(+)·的半数有效浓度(EC_(50))值分别为37.66和38.32μg/mL。当桂花浓度达到2 mg/mL时,FRAP值可高达3.17。桂花水提物抑制酪氨酸酶双酚酶的EC_(50)为595.9μg/mL。通过UPLC-Triple-TOF/MS分析,初步鉴定了桂花水提物中28种化学成分。采用UPLC-PDA-QDa-ABTS^(+)·在线法及UF-LC-MS技术,快速筛选出桂花提取物中5种具有较好抗氧化作用并兼具显著酪氨酸酶结合率的化学成分,鉴定其中主要的活性成分为毛蕊花糖苷。体外抗氧化和酪氨酸酶实验,验证了毛蕊花糖苷具有显著抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性。毛蕊花糖苷清除DPPH·及ABTS^(+)·的EC_(50)值分别为10.27和14.96μg/mL。当毛蕊花糖苷浓度达到1 mg/mL时,FRAP值可高达4.22。毛蕊花糖苷对酪氨酸酶单酚酶的EC_(50)为477.5μg/mL,对双酚酶的抑制活性几乎没有。利用H_(2)O_(2)致皮肤成纤维细胞氧化损伤模型,进一步验证桂花提取物及毛蕊花糖苷对皮肤成纤维细胞氧化损伤具有显著保护作用。结论:桂花水提物及其主要活性成分毛蕊花糖苷具有很好的体外抗氧化能力、酪氨酸酶抑制活性及氧化应激保护能力。

重组人Siglec-1蛋白的制备及基于超滤亲和-液质联用技术天然配体的筛选

目的构建唾液酸免疫球蛋白凝集素1(Siglec-1)原核表达载体,表达纯化Siglec-1重组蛋白,构建超滤亲和-液质联用技术(UF-LC-MS)筛选Siglec-1蛋白天然配体。方法利用DNA重组技术构建Siglec-1重组蛋白原核表达载体,转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达Siglec-1重组蛋白,通过Ni柱亲和色谱柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析Siglec-1重组蛋白纯度。建立UF-LC-MS技术研究金银花、甘草、迷迭香、菊苣中6个主要组分绿原酸、迷迭香酸、阿魏酸、甘草酸、甘草次酸、菊苣酸对Siglec-1蛋白的亲和力,通过比较样品组和蛋白变性组超滤液中待测物的峰面积,计算各待测物特异结合率。结果经双酶切及测序鉴定证明,重组表达质粒pET-22b-Siglec-1-His构建正确;纯化的人Siglec-1重组蛋白质量分数达90%以上;建立了UF-LC-MS筛选体系,筛选出甘草次酸可与Siglec-1蛋白特异性结合。结论成功表达了高纯度、高产量的人Siglec-1重组蛋白,筛选出甘草次酸可与Siglec-1蛋白特异性结合。

超滤亲和-液质联用和分子对接技术筛选毛菊苣根中α-葡萄糖苷酶抑制剂

目的采用超滤亲和-液质联用(Ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry,UF-LC-MS)和分子对接技术筛选毛菊苣Cichorium glandulosum根中α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法通过超滤亲和-液质联用技术筛选并鉴定毛菊苣根中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,发现有4个组分对α-葡萄糖苷酶的活性具有抑制作用,进一步采用分子对接技术对这4个化合物进行验证。结果发现2个化合物对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制作用,其中黄芩苷、山莴苣苦素在0.1～2.0mg/mL呈良好的量效关系。结论为利用UF-LC-MS和分子对接技术筛选天然产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了参考,也为后续研究毛菊苣降糖功效提供了基础。

超滤亲和液质联用技术筛选显齿蛇葡萄叶中酪氨酸酶抑制剂

目的采用超滤亲和-液质联用技术(ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry,UF-LC-MS)结合体外酶活性实验,筛选药茶两用植物显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata叶(藤茶)中的酪氨酸酶抑制剂。方法通过体外酶活实验发现藤茶具有很好的酪氨酸酶抑制活性,采用UF-LC-MS筛选并鉴定藤茶中1个主要组分对酪氨酸酶的活性具有抑制作用,并鉴定为二氢杨梅素。进一步通过体外荧光光谱、圆二色谱和分子对接技术研究了二氢杨梅素对酪氨酸酶的分子作用机制。结果发现二氢杨梅素对酪氨酸酶具有较高的抑制作用,对单酚酶及双酚酶的半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC_(50))分别为37.73、18.87μg/mL。分子模拟结果显示,二氢杨梅素可以进入酪氨酸酶的活性中心,与氨基酸残基形成4个氢键,改变酶活性中心的构象,从而导致酪氨酸酶催化活性下降。此外,二氢杨梅素能明显抑制B16黑色瘤细胞的增殖,并且显著降低黑色素合成。结论为利用UF-LC-MS和分子对接技术筛选药用植物中酪氨酸酶抑制剂提供了参考,也为后续研究和开发藤茶及二氢杨梅素用于治疗皮肤色素沉着性疾病提供理论基础。