基于亲水相互作用色谱-串联离子阱质谱法分析的低聚半乳糖异构体糖苷键的初步鉴定

目的采用亲水相互作用色谱-串联离子阱质谱法分析鉴定低聚半乳糖及其氨基柱分离制备的级分中二糖和三糖异构体组成及其糖苷键特征。方法将二糖和三糖的各个异构体色谱峰的MS^2与MS^3的中性丢失离子特征及相对丰度与文献中相关数据比较,从而推测其异构体结构特征。结果初步定性了量子高科GOS产品中二糖及三糖异构体组成及糖苷键特征;并根据由Sugarpak1色谱柱分离和示差折光检测器检测得到的不同聚合度寡糖的相对百分比及各异构体峰高相对比例计得GOS产品中二糖和三糖的不同糖苷键异构体的相对含量。结论该方法简便、快速,可用于鉴别和表征不同来源的低聚半乳糖产品,有望进一步研究以解決目前乳品饮料等复杂的食品基质中GOS定性定量分析的难题。

超高效液相色谱-紫外检测法测定婴幼儿配方乳粉中的核苷酸含量

采用磺酸甜菜碱型两性离子亲水相互作用色谱法,建立婴幼儿配方乳粉中5种核苷酸(5’-胞嘧啶核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸、5’-次黄嘌呤核苷酸、5’-鸟嘌呤核苷酸)的测定方法。使用二维固相萃取模式,弱阴离子交换和强阳离子交换,对样品中的核苷酸进行提取,紫外检测器采集数据;用0.001%甲酸-乙腈溶液和pH 5的10 mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相,等度洗脱。5种核苷酸在其线性范围内线性关系良好,定量限在0.10~0.15 mg/100 g范围内,方法回收率均在95%以上,精密度在10%以内。该方法快速、灵敏、准确,适合各类婴幼儿配方乳粉中核苷酸的测定。

人尿液N-糖蛋白/N-糖肽规模化富集鉴定

蛋白质的N-糖基化是真核细胞中一种重要的翻译后修饰,N-糖基化修饰在调控细胞黏附、迁移、信号转导及细胞凋亡等方面扮演着关键角色。蛋白质糖基化修饰的异常变化与多种重要疾病的发生相关。尿液具有蛋白质组复杂程度低和非入侵性等特点,适合大量及连续多时间点采样研究。但由于个体差异和生理条件的影响,尿蛋白丰度的生理波动较大。目前缺乏对健康人群尿液N-糖蛋白的个体差异和生理波动的专门性研究,以及生理丰度范围的构建,难以将个体差异、正常生理波动和疾病导致的变化进行有效区分,对疾病标志物研究提出很大挑战。本研究以亲水相互作用色谱法(HILIC)为基础,对该富集方法中活化、清洗与洗脱过程进行优化,其中主要对HILIC填料粒径和富集缓冲体系进行优化,并考察了不同实验条件下N-糖肽富集的鉴定数量、选择性与稳定性,发现当HILIC填料粒径为5μm,在三氟乙酸富集体系下有更高的N-糖蛋白/N-糖肽鉴定水平。在此基础上,对20例健康男性志愿者和20例健康女性志愿者的尿液N-糖蛋白/N-糖肽进行了富集和定性、定量及功能分析。从40例尿液样本中共鉴定到1016个N-糖蛋白、2192条N-糖肽。采用非标定量策略对尿液N-糖肽的生理丰度波动范围进行了考察,尿液N-糖肽的丰度跨度约5个数量级。在此之后探索了健康人群尿蛋白N-糖基化水平的性别差异,筛选出性别相关的差异N-糖蛋白后进行了功能分析。统计学分析显示在尿液样本中性别可能是产生个体差异的重要因素。该工作为基于尿液糖蛋白质组学的功能与机制研究和临床生物标志物筛选提供了有力支撑。

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60~300μg的抗体含量范围内线性良好,r~2≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%~106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%~20%,半乳糖相对含量≥25%。结论 方法学验证结果显示,所有考察项目中该分析方法均满足要求,可用于重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析。本实验建立的相关质量标准适用于重组人源化抗CD52单克隆抗体生产过程中N-糖糖型的质量控制,也可作为该产品未来商业化生产时放行标准的制定依据。