β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达

目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD 2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD 2转化E.coli B J5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pA dE asy-1发生同源重组,重组质粒pA dE asy-rBD 2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用W estern b lot与免疫组化方法检测其表达。结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/m l,W estern b lot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

鼻咽癌患者鼻咽拭子中EB病毒LMP1基因C末端的变异及序列分析

目的研究LMP1基因C端区在宁波地区鼻咽癌患者中的变异状况,并探讨其在鼻咽癌中所起的作用。方法通过鼻咽拭子的方法采集鼻咽癌患者的病变黏膜上皮及分泌物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽拭子中的LMP1基因C末端,并对其进行序列分析。结果30例鼻咽癌患者的鼻咽拭子标本中有28例显示出阳性条带,且都存在序列变异,而正常对照标本无一扩增得到,特异性为100.0%。28例阳性标本中有7例标本存在30 bp的缺失突变,缺失率为25.0%。结论宁波地区的鼻咽癌鼻咽拭子中LMP1基因C端高变区30 bp的缺失型约占25.0%,不是主要流行型。

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒基因分型的研究

【目的】了解宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)的感染及其基因型的分布情况,并探讨人乳头瘤病毒感染及其基因型与癌肿类型的相关性。【方法】采用可检测23种HPV基因型的基因芯片方法分别检测200例宫颈癌组织的HPV基因型,计算宫颈癌组织中HPV及各基因型的感染率,比较HPV及其主要基因型与癌肿类型的关系。【结果】①200例宫颈癌组织中HPV的阳性率为94.00%(188/200),其中鳞癌为95.86%(162/169),显著高于腺癌的80.00%(χ2=9.73,P<0.01),而HPV16、HPV18型和HPV双重感染在鳞、腺癌中的阳性率差异无显著性。②200例宫颈癌组织中共检测到9种HPV基因型,分别为HPV16,18,45,33,58,59,73,31,56,均为高危型感染,其中HPV16最常见,检出率达74.00%(148/200)、其次是HPV18,16.00%(32/200);200例宫颈癌组织中共检测到HPV双重感染24例,检出率达12.00%。【结论】HPV与宫颈癌的关系密切,HPV感染更常见于宫颈鳞癌。但HPV各基因型的分布与宫颈癌的类型无关;宫颈癌的HPV基因型呈多样性,且均为高危型感染,其中以HPV16型最常见,其次是HPV18型,并存在一定数量的双重感染。

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒(HRSV)G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RTPCR技术,从感染HRSV的HEp2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEMTeasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),酶切鉴定后,脂质体法转染COS7细胞,RTPCR和Westernblotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3.1(+)G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS7细胞后,RTPCR检测到G基因有转录,Westernblotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。

宫颈癌组织中HPV16E6序列多态性及同源性分析

目的:探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E6基因序列的多态性及同源性.方法: 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E6,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而分析其同源性.结果: 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例.含有HPV16型的标本34例中扩增出HPV16E6 25例.其中178位核苷酸变异较大,变异率为72%,其相应氨基酸均由天冬氨酸变为谷氨酸.结论: HPV16E6 DNA序列发生碱基替换的区域主要在氨基端94～241位,羧基端相对保守,未见变异.广东地区宫颈癌组织中HPV16E6的热点突变为Nt178.

鼻咽癌体外传代细胞株SUNE中EBV-LMP_1全基因的扩增

用长片段高保真度ＰＣＲ扩增系统（ｅｘｐａｎｄＴＭｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ）从鼻咽癌（ＮＰＣ）体外传代细胞株ＳＵＮＥ中扩增出ＥＢ病毒（ＥＢＶ）潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）全基因，经凝胶电泳分析和ＤＮＡ斑点杂交进行鉴定。扩增片段长度为３．４３ｋｂ，相当于Ｂ９５－８细胞ＥＢＶ基因序列位置为１７００３３～１６６６０８ｎｔ，包括ＬＭＰ１基因的上游启动子／增强子序列、ＬＭＰ１编码序列的３个外显子、两个内含子及下游ｐｏｌｙＡ信号序列。ＬＭＰ１全基因的扩增对于深入研究ＬＭＰ１基因的结构与功能以及ＬＭＰ１在ＮＰＣ发生发展中的作用机制具有十分重要的价值。

定量PCR检测外周血EB病毒DNA在诊断鼻咽癌中的Meta分析

目的:系统评价定量PCR检测外周血EBV-DNA在诊断鼻咽癌中的作用。方法:检索国内外各数据库,用RevMan软件进行Meta分析。结果:NPC患者外周血EBV-DNA阳性率高于正常人,定量PCR诊断NPC的敏感性和特异性高于EBV-VCA-IgA检测,检测血清或血浆DNA的敏感性高于白细胞,比较均有统计学意义。结论:定量PCR检测外周血EBV DNA在诊断鼻咽癌中具有重要意义。

HPV-DNA检测对宫颈癌诊断的临床指导

目的探讨检查女性生殖道感染HPV-DNA对诊断宫颈癌临床指导意义。方法选择2860例宫颈炎患者,随机分两组,一组用传统宫颈刮片法检测,一组用HPV-DNA+宫颈刮片法检测。结果用HPV-DNA+宫颈刮片法检测率达98.5%,用传统宫颈刮片法检测率73%。结论 HPV-DNA检测可提高宫颈癌诊断。

大连市儿童手足口病肠道病毒71型基因型别和毒力位点分析

目的分析大连市引起儿童手足口病(hand-foot-mouth Disease,HFMD)的肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)VP1基因特征,寻找与毒力相关的基因位点。方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对HFMD轻症和重症临床标本进行EV71的VP1全基因扩增,分析扩增产物同源性,并与各基因型代表株构建进化树,比对分析轻症和重症间EV71的VP1基因。结果扩增产物核苷酸和蛋白质序列与C4a亚型具有较高的同源性,在系统进化树上,与C4a亚型处于同一分支。轻症和重症EV71的VP1基因无共同差异位点。结论大连市HFMD病原体EV71为C4a亚型,EV71存在多种传播链,在VP1基因上未发现与毒力相关的基因位点。

HPV-DNA分型检测及阴道镜检查ASCUS 108例分析

目的探讨HPV-DNA分型检测对TCT结果为ASCUS患者分流处理中的作用。方法对108例TCT结果为ASCUS患者同时行HPV-DNA分型检测及阴道镜检查,以阴道镜病理检查结果为金标准,计算HPV在诊断宫颈病变中灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。结果 HPV在诊断宫颈病变中灵敏度100%,特异性26.6%,阳性预测值13.15%,阴性预测值100%。结论 HPV DNA分型检测对TCT结果为ASCUS患者有分流处理的作用。

HPV—DNA在宫颈疾病中的检测价值分析

目的讨论HPV—DNA在宫颈疾病中的监测价值。方法采用二代杂交捕获技术分别检测577例宫颈疾病患者，并借助病理学镜检辅助确诊。结果在上述病例中，HPV—DNA检验出慢性宫颈炎313例（阳性率54．13％）、宫颈上皮内瘤变164例（阳性率78．05％）、HPV亚临床感染92例（阳性率90．22％）、宫颈癌HPV高危型DNA的表达8例（阳性率100％）。结论HPV—DNA高危型检测对早期发现宫颈疾病具有临床意义。