人β-防御素-2基因表达及其抗菌活性

目的获得人β-防御素-2(humanβ-defensin-2,hBD2)基因并构建其真核表达载体,转染小鼠纤维母细胞(L929),检测其表达,观察hBD2的体外抗菌活性。方法采用逆转录(RT)-PCR方法从人宫颈癌组织获取人β-防御素-2基因,然后进行克隆扩增,重组真核表达载体pCAGG-hBD2,通过磷酸钙共沉淀法将pCAGG-hBD2导入L929细胞,并用RT-PCR法检测hBD2的表达,用Kirby-Bauer纸片扩散法检测其抗菌活性。结果RT-PCR凝胶电泳及测序分析的结果显示,所克隆的hBD2基因序列正确,并成功构建了真核表达载体pCAGG-hBD2。Kirby-Bauer纸片法显示,hBD2对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有明显的杀灭效应。结论转染pCAGG-hBD2的L929细胞能高效表达hBD2,其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有杀灭作用。

人β-防御素-2在慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中的表达

目的测定慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者诱导痰中人β-防御素-2(hBD-2)的表达水平,来探讨hBD-2在COPD中的可能作用。方法收集COPD急性加重期、稳定期患者及正常人的诱导痰各10例,处理后分别进行痰细胞的计数和分类,Westernblottinganalysis法检测诱导痰中hBD-2的表达水平,并以图文分析系统进行灰度的半定量对比,同时用ELISA法测定诱导痰中白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平,并与hBD-2的表达进行相关分析。结果与正常组比较,COPD急性加重期组和稳定期组的中性粒细胞比例明显增多(P<0.01),而COPD急性加重期组和稳定期组的hBD-2蛋白表达灰度值明显降低,差异有显著性(P<0.001);与稳定期组比较,COPD急性加重期组hBD-2蛋白表达灰度值也明显降低,差异有显著性(P<0.01)。COPD稳定期组的IL-1β表达与正常组比较升高,差异有显著性(P<0.001);与COPD稳定期组比较,COPD急性加重期组IL-1β表达明显升高,差异有显著性(P<0.01)。hBD-2的蛋白印迹的灰度值与IL-1β的浓度呈显著负相关(r=-0.689,P<0.01)。结论COPD患者诱导痰中hBD-2表达增高,并与IL-1β有相关性,提示hBD-2可能参与了COPD的炎性过程。

重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立

目的 运用植物转基因技术 ,探索构建表达人类 β-防御素 - 2 ( h BD- 2 )的植物生物反应器的可能性及技术路线。方法 将 C端带 myc和 6x His双标记的重组 h BD- 2基因插入植物真核表达载体 p CAMBIA13 0 4中 ,构建 C端带 m yc和 6x His双标记的重组 h BD- 2植物真核表达载体 rp CAMBIA13 0 4/ h BD- 2 / His。利用此载体转化根癌农杆菌 L BA44 0 4,经卡那霉素进行抗性基因筛选和 PCR检测 ,确定根癌农杆菌的阳性克隆。重组 h BD- 2通过转化阳性的根癌农杆菌被导入小麦幼胚愈伤组织细胞 ,经潮霉素进行抗性基因筛选 ,获得抗性愈伤组织。结果 酶切分析、PCR验证和 DNA测序等证据表明 :C端带 m yc和 6x His双标记的重组 h BD- 2已被正确地插入 p CAMBI-A13 0 4载体中 ,并位于 Ca MV 3 5 S与 Nos终止子之间 ,提示重组 h BD- 2 / His基因的植物表达载体 rp CAMBI-A13 0 4/ h BD- 2 / His已被成功构建。卡那霉素抗性基因筛选和 PCR检测显示 :rp CAMBIA13 0 4/ h BD- 2 / His已成功转化根癌农杆菌 L BA44 0 4,阳性克隆菌株已获得。潮霉素抗性筛选结果提示 :h BD- 2基因被导入小麦幼胚愈伤组织细胞。结论 本研究为进一步培育 h BD-

人β-防御素-2在涎腺肿瘤及涎腺炎症中的表达及其意义

目的研究涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织和涎腺炎症中人β-防御素-2(HBD-2)mRNA和蛋白的表达特征。方法对不同涎腺组织,采用聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)和免疫组化检测HBD-2的表达,并分析HBD-2 mRNA和蛋白在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中的表达差异。结果与涎腺正常组织比较,良性肿瘤组HBD-2 mRNA表达量为其6.468倍,显著高于涎腺正常组织组(P<0.05);恶性肿瘤组为其0.334倍,显著低于涎腺正常组织组(P<0.05);涎腺炎症组为其10.563倍,显著高于涎腺正常组织组(P<0.05)。HBD-2不仅在这些组织的细胞质中有表达,而且在恶性组织中的细胞核也有表达。结论HBD-2在涎腺良性肿瘤组织及涎腺炎症组织中高表达,在涎腺恶性肿瘤组织中低表达,其蛋白发生核转移。

人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD

衣原体性宫颈炎人β-防御素-2 mRNA的表达

目的探讨衣原体感染的非淋菌性宫颈炎患者人β-防御素-2(HBD-2)mRNA的表达情况。方法采用RT-PCR法进行HBD-2 mRNA研究,并以15例正常组织做对照。结果正常人和患者均可检测到HBD-2 mRNA表达,但衣原体感染的非淋菌性宫颈炎患者表达明显增多。结论HBD-2参与了衣原体性宫颈炎发病过程。

人β-防御素-2在肝细胞癌中的表达及其意义

目的:探讨人β-防御素-2(HBD-2)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其意义。方法:收集2011年8月-2014年10月手术切除的原发性肝癌标本45例,肝癌癌旁组织30例,正常肝组织20例,采用免疫组化法检测各标本中HBD-2蛋白表达情况,采用聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测HBD-2 m RNA表达情况,同时采用原位末端标记法(TUNEL法)测定癌组织的细胞凋亡指数。结果:HBD-2 m RNA及HBD-2蛋白在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达情况比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HBD-2蛋白表达阳性的肝癌组织的细胞凋亡指数高于HBD-2蛋白表达阴性的肝癌组织,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HBD-2在肝细胞癌组织中低表达,HBD-2可能通过影响肝癌细胞的凋亡而起作用。

人β-防御素-2基因治疗大鼠泌尿系感染的实验研究

目的观察基因重组人β-防御素-2（human beta—defensin-2，hBD2）对大鼠模型大肠埃希菌致泌尿系感染的保护作用。方法健康成年雌性SPF级Wistar大鼠56只，随机分为hBD，组与对照组，hBD2组大鼠经逆行膀胱灌注给予脂质体包裹的hBD2重组真核表达载体（pCAGG—hBD2）250μl，对照组同法给予等量空载体（pCAGG），48h后2组大鼠均膀胱灌注1×10^8CFU／mlUT189200μl，制备大肠埃希菌泌尿系感染大鼠模型，分别于不同时间点处死大鼠获取膀胱组织及尿液进行菌落计数、尿液白细胞计数，观察膀胱组织病理学变化并进行炎症评分。结果在感染后24、48、72h，hBD2组大鼠尿液UT189菌落计数分别为（6．43±1．04）、（5．66±0．68）、（1．55±1．17）Log10CFU／ml；膀胱组织UT189菌落计数分别为（6．07±0．52）、（5．17±1．21）、（1．18±0．84）Log10CFU／g；尿白细胞计数分别为（25．1±2．9）、（16．4±7．1）、（11．0±3．0）×10^4cells／ml；膀胱组织炎症评分（2．21±0．45）、（1．30±0．40）、（1．28±0．28）。对照组大鼠尿液UT189菌落计数分别为（8．85±0．79）、（8．07±1．30）、（7．93±2．89）Log10CFU／ml；膀胱组织UT189菌落计数分别为（7．82±1．29）、（7．99±1．71）、（6．73±1．59）Log10CFU／g；尿白细胞计数分别为（168．0±14．9）、（234．5±31．3）、（270．0±22．1）×10^4cells／ml；膀胱组织炎症评分（3．30±0．41）、（4．13±0．13）、（4．72±0．24）。hBD2组大鼠感染后24，48和72h尿液及膀胱组织中大肠杆菌菌落计数、尿白细胞计数及组织炎症评分均显著低于对照组，组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论基因重组hBD2对大肠埃希菌致泌尿系感染有显著的预防及治疗作用，可能与其杀菌作用和抑制炎症反应有关。

人β-防御素-2与肺部疾病的研究进展

人β-防御素-2（human β-defensin2，HBD-2）是一类在肺部诱导性表达的抗菌肽。在呼吸系统的防御中发挥着重要作用。本文就HBD-2的分子结构、生物学活性、表达凋控及其在呼吸系统疾病中的研究进展进行综述。

托法替布治疗的中、重度银屑病患者血清细胞因子及人β-防御素-2的水平

目的探讨中、重度斑块型银屑病患者接受JAK抑制剂托法替布治疗前后血清细胞因子、人β-防御素-2(h BD-2)水平变化。方法将18例中、重度银屑病患者随机给予安慰剂、托法替布5mg,2次/d或10mg,2次/d治疗16周。在基线、第8周、第16周,评价患者的银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI),同时分别采用流式微珠检测技术(CBA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-α,IFN-γ,IL-17A和血清h BD-2水平。结果经过16周,接受托法替布5mg,2次/d和10mg,2次/d治疗的银屑病患者的PASI显著下降(P<0.05),血清各细胞因子水平无明显差异。托法替布10mg治疗组的血清h BD-2显著降低且低于安慰剂组(P<0.05)。此外血清h BD-2与PASI显著相关(r=0.52,P<0.01)。而血清IL-6水平与PASI不相关。结论血清h BD-2水平和银屑病严重程度相关,并可以反映托法替布的疗效。

龈沟液β-防御素-2、β-防御素-3在慢性牙周炎与2型糖尿病中的水平研究

目的通过检测龈沟液中β-防御素2、β-防御素3的表达水平,探讨其在慢性牙周病与2型糖尿病中的可能作用。方法选取慢性牙周炎伴2型糖尿病组(T2DMCP组)20例,2型糖尿病组(T2DM组)20例,慢性牙周炎组(CP组)20例,健康组(H组)20例作。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测龈沟液中β-防御素-2和β-防御素-3水平。比较组间龈沟液中β-防御素-2和β-防御素-3水平的差异性,分析β-防御素-2和β-防御素-3之间的相关性与β-防御素-2和β-防御素-3与牙周指标的相关性。结果 CP组、T2DM组、T2DMCP组的临床指标PD、CAL、BI和GCF量均高于H组(P<0.05)。T2DMCP组的PD、CAL、BI和GCF量均高于T2DM组和CP组(P<0.05)。龈沟液中β-防御素-2,β-防御素-3水平在H组高于CP组、T2DM组和T2DMCP组(P<0.05),CP组和T2DM组高于T2DMCP组(P<0.05)。龈沟液中β-防御素-2水平与β-防御素-3水平呈正相关(P<0.05)。结论慢性牙周炎和2型糖尿病可降低龈沟液β-防御素-2和β-防御素-3的水平,提示β-防御素-2、β-防御素-3对牙周组织起保护作用。

白介素17A对口腔黏膜上皮细胞抗念珠菌黏附及β-防御素-2表达的影响

目的:探讨白介素17A(IL-17A)对白色念珠菌Candida albicans(C.a)感染的人口腔黏膜上皮细胞(OMECs)β-防御素-2(hBD-2)表达的影响。方法:将OMECs分为空白对照组、单独重组人IL-17A(rhIL-17A)处理组、单独C.a处理组(模型组)及C.a与rhIL-17A共同处理组(实验组)。按菌∶细胞=1∶10建立C.a感染的OMECs模型。分别将单独rhIL-17A处理组和实验组的OMECs按所加入的rhIL-17A浓度分为4个亚组:1μg/L组、10μg/L组、100μg/L组及1 000μg/L组,共培养48h。收集不同时间点(0h、12h、24h、48h)的细胞培养上清液,计算C.a黏附率;分别采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测hBD-2mRNA相对表达量及蛋白水平。结果:与模型组比较,实验组C.a黏附率有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度的rhIL-17A均能诱导OMECs表达hBD-2,且100μg/L组hBD-2mRNA相对表达量及蛋白水平升高最为显著(P<0.01)。采用100μg/L rhIL-17A刺激OMECs 12h、24h、48h后,hBD-2mRNA及蛋白水平均升高,且48h时hBD-2mRNA及蛋白水平显著高于0h和12h(P<0.05或P<0.01)。结论:IL-17A能诱导OMECs表达hBD-2,但对口腔黏膜上皮抗C.a黏附无明显作用。

人β-防御素-2基因预防感染性结石的实验研究

目的:通过对膀胱感染性结石大鼠膀胱灌注脂质体包裹的人β-防御素-2重组真核表达载体(pCAGG-hBD2),观察人β-防御素-2(hBD2)基因对感染性结石的预防作用。方法:选择健康成年雄性SD大鼠40只,随机分为实验组与对照组。实验组膀胱灌注pCAGG-hBD2 250μl,对照组经同法给予等量空载体(pCAGG)。2天后,两组均随机处死3只大鼠,利用小动物成像仪观察重组hBD2在SD大鼠膀胱黏膜的表达;转染成功后,两组均膀胱内置入含菌(奇异变形杆菌)聚乙烯管异物,分别于24、48、72小时收集尿液,进行尿液菌落计数、白细胞计数。30天处死全部大鼠获取膀胱组织,观察结石的形成情况及膀胱组织病理学变化。结果:实验组大鼠置入含菌(奇异变形杆菌)聚乙烯管异物24、48、72小时后,尿液中奇异变形杆菌菌落总数、尿白细胞计数均显著低于对照组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.001);实验组和对照组不同时间大鼠尿液中奇异变形杆菌菌落总数及尿白细胞计数差异有统计学意义。对照组大鼠的尿路组织主要表现为肾输尿管膀胱的炎症改变,膀胱内有感染性结石的形成;实验组大鼠的尿路组织病理学无明显变化,膀胱内无结石生成。结论:重组hBD2基因对奇异变形杆菌致泌尿系感染性结石有预防作用。

胎膜早破患者HBD-2、NF-κB p56的表达及其相关性

目的：探讨孕妇血清、胎盘、胎膜中人β-防御素-2（Human beta-defensins-2,HBD-2）、核因子-κB（nuclear factor-κB p56,NF-κB p56）水平相关性,以及与胎膜早破（Premature Rupture of Membrane,PROM）的关系,初步探讨 HBD-2、NF-κB p56在PROM的作用,为临床诊治PROM提供新的思路.方法：PROM组：妊娠37～42周35例,34～36＋6周35例,28～33＋6周25例;与胎膜早破组孕周、例数相对应的95例非胎膜早破孕妇作为对照组.根据胎膜病理诊断结果,在PROM组分为绒毛膜羊膜炎组（histological chorioamnionitis,HCA）组与非HCA组,采用ELISA两步法测定外周血HBD-2、NF-κB p56,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测胎盘,胎膜HBD-2、NF-κB p56的mRNA表达,比较胎膜早破组与对照组,HCA组与非HCA组在不同孕周孕妇血清,胎盘,胎膜HBD-2、NF-κB p56测定结果的差异,并进行相关性分析.结果：（1）妊娠37～42周：PROM组孕妇入院血清,分娩结束血清,胎盘,胎膜HBD-2、NF-κB p56 的表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P均〉0.05）;（2）妊娠34～36周＋6 和妊娠28～33周＋6：PROM组孕妇入院血清,分娩结束血清,胎盘,胎膜HBD-2、NF-κB p56的表达显著高于对照组（P均〈0.05）;PROM组分娩结束血清HBD-2、NF-κB p56的表达高于入院血清,差异有统计学意义（P均〈0.05）;（3）HCA组孕妇分娩结束血清,胎盘,胎膜中HBD-2、NF-κB p56的表达与非HCA组比较,差异有统计学意义（P均〈0.05）,而入院血清HBD-2、NF-κB p56表达差异无统计学意义（P均〉0.05）;（4）妊娠37～42周：入院血清,分娩结束血清,胎盘,胎膜表达HBD-2、NF-κB水平无相关关系（P〉0.05）,同一组织中HBD-2与NF-κB p56水平无相关关系（P〉0.05）;（5） 妊娠34～36周＋6和妊娠28～33周＋6：入院血清HBD-2,分娩结束血清HBD-2呈正相关r=0.82（P＜0.01）,入院血清HBD-2,分娩结束血清HBD-2均与胎盘HBD-2水平呈正相关关系r=0.66、0.65（P＜0.01）,入院血清HBD-2,分娩结束血清HBD-2与胎膜HBD-2呈正相关关系r=0.69、0.72（P＜0.01）,胎盘HBD-2与胎膜HBD-2呈正相关关系r=0.79（P＜0.01）.NF-κB p56在各组织中的关系与HBD-2类同,同一组织中HBD-2与NF-κB p56表达成正相关关（P＜0.01）.结论：HBD-2与NF-κB p56的表达与早产PROM密切相关.其作用机制可能是多方面的因素共同启动宿主剧烈的免疫应答,通过介导NF-κB p56转导途径产生大量HBD-2等引起胎膜完整性受损可能是其主要的机制所在.

LPS介导滋养层细胞TLR4信号传导通路对HBD-2表达的影响

目的研究LPS体外刺激滋养层细胞是否诱导表达HBD-2,并进一步探讨该表达与TLR4信号传导通路的关系。方法建立不同孕周的滋养层细胞原代培养体系,应用TLR4阻断剂预处理滋养层细胞30 min前后,给予不同质量浓度的LPS(25、50、100、200、400 ng/ml)作用72 h,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测滋养层细胞HBD-2 mRNA的表达。结果 1)LPS能诱导滋养层细胞HBD-2 mRNA表达,且这种表达与其具有浓度和时间依赖性;当质量浓度为200 ng/ml,刺激24 h时,HBD-2 mRNA的相对表达量最高;2)TLR4阻断剂能抑制LPS对滋养层细胞表达HBD-2 mRNA的诱导作用,与未阻断之前相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 LPS可能通过TLR4信号传导通路诱导滋养层细胞表达HBD-2 mRNA,将为宫内感染防治提供新靶点。

人β防御素2和白介素1β在中耳黏膜上皮的表达

目的研究人β-防御素-2(HBD-2)、白介素-1β(IL-1β)在中耳黏膜上皮中的表达情况,探讨其在中耳炎病理发展过程中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测慢性中耳炎中耳黏膜上皮及正常外耳道皮肤中HBD-2、IL-1β的表达。结果 HBD-2和IL-1β在中耳炎中耳黏膜的表达较正常外耳道皮肤中上调,有显著性差异(P<0.05);HBD-2和IL-1β在中耳黏膜中的表达有一定的相关性(r=0.9117,P<0.05)。结论中耳炎症状态下,中耳黏膜上皮HBD-2、IL-1β表达上调并可能相互影响,在中耳炎病理发展中发挥一定的作用。

新型非病毒载体O-CHCS携带HBD2转染L929细胞及表达产物活性检测

目的研究O-胆甾醇基壳聚糖(O-CHCS)作为基因载体进行人β防御素-2(HBD2)基因转染小鼠纤维母细胞L929的可行性及检测目的基因表达产物的生物活性。方法构建重组质粒pCMV-hBD2,通过O-CHCS介导转染于L929细胞,提取转染细胞总RNA,用RT-PCR检测HBD2基因转录水平;收集转染细胞培养上清液,用Westernblotting检测HBD2基因蛋白的表达;用Kirby-Bauer纸片法检测HBD2抗菌活性,同时以Lipofect脂质体转染试剂作为阳性对照。结果经过O-CHCS介导转染的L929细胞,目的基因HBD2在转录水平和蛋白水平均有表达,转染细胞上清液对金黄色葡萄球菌有抑菌圈形成,结果同Lipofect的转染效果基本一致。结论成功构建了真核表达载体pCMV-hBD2,证实了O-CHCS可以作为基因载体用于目的基因HBD2的转染,且目的基因表达产物具有生物活性,为基因工程合成HBD2提供一条经济便捷的途径。

吸烟对牙周病患者牙龈组织中hBD-2、hBD-3表达的影响

目的通过观察吸烟、非吸烟牙周炎人群牙龈组织中β防御素2、3的表达,探讨吸烟与牙周炎的关系。方法选取2018年3月～8月在我院口腔科就诊的诊断为牙周炎的患者40作为研究对象,将其分为吸烟组(吸烟者)和非吸烟组(非吸烟者),各20例,应用免疫组织化学染色及Image-Pro Plus 6.0图像处理分析系统检测牙龈组织中hBD2和hBD3的分布和表达并进行统计分析。结果无论是吸烟还是非吸烟牙周炎患者牙龈组织中均有hBD2和hBD3的表达,且吸烟组hBD2和hBD3的表达强度均明显低于非吸烟组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论吸烟可能会通过牙龈组织中hBD2和hBD3的表达减弱,降低机体的防御能力,促进牙周炎的进一步发展,对患者产生消极影响。

乳杆菌细胞壁成分激活人阴道上皮细胞β-防御素-2表达机制研究

目的探讨乳杆菌细胞壁成分（Lactobacillus cell wall extract，LCWE）对人阴道上皮细胞β-防御素之的诱导作用及细胞内信号转导机制。方法采用实时定量PCR和Western blot方法检测LCWE处理对人阴道卜皮细胞（WZV-1）β-防御素-2表达的影响；Western blot方法检测LCWE处理后WZV-1细胞内NF-κB和p38MAPK信号通路活化情况；实时定量PCR和Westernblot方法检测NF-κB抑制剂和p38MAPK抑制剂预处理WZV-1细胞对LCWE诱导β-防御素-2表达的影响。结果LCWE可诱导WZV-1细胞β-防御素-2表达且存在着明显的时间效应和剂量依赖关系，50μg／mlLCWE处理细胞8h对β-防御素-2的i：调幅度最大，刺激0．5h后可引起细胞内p38MAPK蛋白的磷酸化显著增加，1h达到顶峰；刺激0．5h后可引起细胞核内NF-κB含量显著增加（P〈0．05），2h达到顶峰。NF-κB抑制剂PDTC、p38MAPK抑制剂SB20380预处理WZV-1细胞，可明显抑制LCWE诱导WZV-1细胞β-防御素-2的表达。结论LCWE具有激活NF-κB和p38MAPK信号通路诱导阴道上皮细胞β-防御素-2的作用。