人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。

乳腺特异性人α-乳白蛋白真核表达载体的构建

从正常人血液中提取人基因组DNA。以其为模板,扩增人α-乳白蛋白(α-LA)2.36kb的总DNA序列,经测序鉴定后,将其连接到PSV载体SV40启动子后,构建真核表达载体LA-DNA-psv.扩增牛XS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段,测序鉴定。切去LA-DNA-psv载体原来的SV40启动子,连接牛αS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段为启动子,构建真核表达载体αS1-LA-DNA-psv。为在动物乳腺中特异高效表达人α-乳白蛋白做准备研究。

人α-乳白蛋白在转基因小鼠乳汁中的动态表达图貌

利用人α-乳白蛋白基因(hα-Lac)探针从8×105个噬斑中筛选出两个阳性克隆,以此构建了包含有7.3kb的hα-lac的5′调控序列、2.0kb的编码区和227 bp的牛生长激素3′UTR的乳腺表达框架.通过显微注射方法获得5只hα-Lac转基因整合雌性小鼠.对其中1只转基因表达量较高(达到0.3 mg/mL)的小鼠的一个泌乳期中人乳白蛋白的表达过程分析表明:转基因并不遵从小鼠内源的α-Lac的表达图貌,而是以转基因特异的方式表达,表现为在分娩后的前3天转基因的表达低,自第4天开始逐渐增高,到第13～14天达到峰值后渐趋稳定,并持续到泌乳期结束.在第2个泌乳期中,转基因的表达量与首次泌乳期的水平相当.此外,转基因表达小鼠的泌乳量较正常小鼠和非表达整合小鼠有一定的增加,提示泌乳过程中较高浓度的α-Lac可能引发了产乳量的增加.

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体αS1-LA-psv.采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力.将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64g/L.实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶.

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料，构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列，通过PCR的方法，扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段，构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作，可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后，高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序，将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测，证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此，大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC，将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。