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连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座
1
作者
张伟
林艳丽
+6 位作者
周艳荣
左珊珊
吴晓洁
熊福银
刘芳
尤平
陈红星
《生物技术通讯》
CAS
2012年第5期653-657,共5页
目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修...
目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。
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关键词
细菌人工染色体
缺口修复
人β肌动蛋白
凝血因子Ⅶ
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职称材料
人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化
2
作者
宋烨琼
郭靖
+6 位作者
徐小洁
李玲
梁迎春
洪甜
纪贝贝
叶棋浓
吕朝晖
《生物技术通讯》
CAS
2015年第6期783-785,共3页
目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确...
目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。
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关键词
人β肌动蛋白
原核表达
纯化
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职称材料
题名
连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座
1
作者
张伟
林艳丽
周艳荣
左珊珊
吴晓洁
熊福银
刘芳
尤平
陈红星
机构
陕西师范大学生命科学学院
军事医学科学院生物工程研究所
安徽大学生命科学学院
出处
《生物技术通讯》
CAS
2012年第5期653-657,共5页
文摘
目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。
关键词
细菌人工染色体
缺口修复
人β肌动蛋白
凝血因子Ⅶ
Keywords
bacterial artificial chromosome
gap-repair
β-actin
human coagulation factor VII
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化
2
作者
宋烨琼
郭靖
徐小洁
李玲
梁迎春
洪甜
纪贝贝
叶棋浓
吕朝晖
机构
解放军总医院内分泌科
军事医学科学院生物工程研究所
出处
《生物技术通讯》
CAS
2015年第6期783-785,共3页
基金
国家自然科学基金(81372161
81472589
+3 种基金
31100604)
北京市科技新星计划(Z141102001814055)
北京市自然科学基金(7132155)
军事医学科学院创新基金转化医学项目(ZHYX003)
文摘
目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。
关键词
人β肌动蛋白
原核表达
纯化
Keywords
human β-actin gene
prokaryotic expression
purification
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座
张伟
林艳丽
周艳荣
左珊珊
吴晓洁
熊福银
刘芳
尤平
陈红星
《生物技术通讯》
CAS
2012
0
下载PDF
职称材料
2
人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化
宋烨琼
郭靖
徐小洁
李玲
梁迎春
洪甜
纪贝贝
叶棋浓
吕朝晖
《生物技术通讯》
CAS
2015
0
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