人β防御素4基因的合成及克隆载体的构建

目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并导入细菌中进行扩增.结果：HBD4基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、 测序分析证实, 合成的目的基因与设计的HBD4 cDNA的序列相一致, 并成功地克隆入克隆载体pMD18-T中.结论：用重叠延伸PCR法能方便、 准确地获得目的基因片段.重组克隆载体pMD18-T-HBD4 的获得, 为构建HBD4基因的表达载体并表达奠定了基础.

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性。方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5mmol/L IPTG诱导表达4h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性差异。结果GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉西林和环丙沙星。结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景。

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体。方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白。以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定。结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32000的融合蛋白GST-HBD4。ELISA法检测抗血清的效价可达到1∶128000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合。结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础。

人β防御素4基因原核表达载体的构建及其表达

人β防御素4(Human β defensin 4,HBD4)是一种具有广谱抗微生物活性的抗菌肽。在人体先天免疫尤其上皮及黏膜防御中起重要作用。本研究用重叠延伸PCR扩增合成HBD4cDNA全长,并克隆入pMD18-T载体,用PCR法扩增HBD4成熟肽(mature HBD4,mHBD4)编码序列并克隆入表达载体pGEX-4T-2中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导下,表达HBD4与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的融合多肽。用酶切鉴定、核酸测序、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行鉴定。结果表明:我们成功合成了HBD4全长编码基因,构建了克隆载体pMD18-T/HBD4和原核表达载体pGEX-4T-2/mHBD4,并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-HBD4。

人β防御素4对神经母细胞瘤细胞增殖凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察人β防御素4(HBD4)对神经母细胞瘤(NB)细胞的杀伤作用,探讨HBD4对NB细胞增殖、凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响。方法将HBD4作用于NB细胞,根据HBD4终浓度将NB细胞分为A、B、C 3组,浓度分别为5、10、20mg·L-1;HBD4作用时间分别为12、24、48h。噻唑蓝(MTT)法测定HBD4对NB细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测HBD4作用于NB细胞后细胞凋亡情况;分光光度法检测HBD4对NB细胞Caspase-3蛋白表达的影响。结果 MTT检测结果:NB细胞抑制率均随HBD4浓度的升高而升高(P<0.01),随HBD4作用时间的延长而升高(P<0.01),提示HBD4对NB细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性;流式细胞仪检测结果显示:A、B、C三组NB细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01)。三组NB细胞凋亡率比较亦有显著差异(P<0.01),说明随药物浓度的增加,细胞凋亡率呈增高趋势;分光光度法检测结果显示:A、B、C三组NB细胞Caspase-3含量均高于对照组(P<0.01)。三组NB细胞Caspase-3含量比较亦有显著差异(P<0.01),说明随药物浓度的增加,细胞Caspase-3含量呈增高趋势。结论HBD4对NB细胞增殖具有抑制作用;HBD4可诱导NB细胞凋亡;HBD4可能是通过激活Caspase-3诱导NB细胞凋亡。

人β防御素4对神经母细胞瘤细胞的杀伤作用

目的观察人β防御素4(HBD4)对神经母细胞瘤(NB)细胞的杀伤作用,探讨HBD4杀伤肿瘤细胞的机制。方法HBD4多肽通过基因工程方法表达并纯化获得,NB细胞来源于临床病理诊断为NB的女性患儿肿瘤标本,经细胞培养传代获得。将HBD4作用于NB细胞,根据HBD4终质量浓度将NB细胞分为A、B、C、D 4组,质量浓度分别为0μg.L-1、20μg.L-1、40μg.L-1、100μg.L-1;根据HBD4作用时间又分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3组,时间分别为6 h、12 h、24 h。倒置相差显微镜下观察NB细胞形态,噻唑蓝(MTT)法测定HBD4对NB细胞的杀伤作用,扫描电镜观察细胞表面变化。结果 HBD4处理6 h后细胞大小、形态和贴壁能力与A组有明显差异:B组细胞形态变化不大,贴壁尚可;C组细胞明显皱缩,突起少见,细胞内颗粒颜色加深,折光性增强,大量细胞脱落。D组作用12 h后,大部分细胞死亡。MTT结果显示:D组随HBD4作用时间的延长,细胞数显著减少(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组:随HBD4浓度增加,细胞数均显著减少(P<0.01),提示HBD4对NB细胞的杀伤作用具有时间和剂量依赖性。扫描电镜结果提示:NB细胞经HBD4作用12 h,细胞表面微绒毛消失,出现不规则孔洞细胞膜骨架严重破坏,而A组细胞膜结构完整无损。结论 HBD4对NB细胞具有杀伤作用;HBD4可通过破坏细胞膜的结构杀伤肿瘤细胞。

人β防御素-4在牙龈组织表达的新发现

目的探讨牙龈组织中是否存在β防御素-4(hBD-4)及其分布情况。方法收集健康牙龈标本。采用免疫组织化学法检测18例牙龈组织标本hBD-4蛋白水平的分布;提取组织RNA,进行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测30例牙龈标本中hBD-4基因的表达水平。结果免疫组织化学检测结果显示,18例牙龈样本中有13例检出hBD-4;real time RT-PCR检测结果显示,30例牙龈组织中4例样本检测出hBD-4表达。结论hBD-4在健康牙龈组织中有不同水平的表达和分布,可能在维持牙周组织健康中起作用。