人β-防御素3水凝胶治疗大鼠牙周炎

背景:既往研究显示人β-防御素3具有显著的抗真菌、抗细菌和抗病毒活性,并且在连接先天和获得性免疫应答中起到重要的桥梁作用。目的:观察人β-防御素3水凝胶治疗大鼠牙周炎的效果。方法:以泊洛沙姆188与407为基质,采用冷溶法构建空白水凝胶,将人β-防御素3与该水凝胶混合制备人β-防御素3水凝胶。将25只SD大鼠随机分为5组,每组5只:健康组不做任何处理,牙周炎组、空白水凝胶组、盐酸米诺环素组、载药水凝胶组采用正畸结扎钢丝法构建牙周炎模型,造模8周后于颊侧与腭侧牙周袋内分别注射空白水凝胶、盐酸米诺环素、人β-防御素3水凝胶,1次/周,连续给药4周后进行相关检测。结果与结论:①与健康组比较,牙周炎组大鼠牙周菌斑指数、牙龈出血指数及牙周探诊深度均增加(P<0.01);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组与载药水凝胶组大鼠牙周菌斑指数、牙龈出血指数及牙周探诊深度均减少(P<0.05);②大鼠脏器苏木精-伊红染色显示载药水凝胶无毒性作用;③体视显微镜与Micro CT扫描显示,与健康组比较,牙周炎组大鼠牙根暴露及釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离均增加(P<0.05);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组与载药水凝胶组大鼠牙根暴露、釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离均减少(P<0.05);④苏木精-伊红、Masson及抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,牙周炎组、空白水凝胶组大鼠牙周炎症明显、纤维结构混乱、破骨细胞活跃,盐酸米诺环素组、载药水凝胶组大鼠牙周炎症水平降低、纤维排列较规则、破骨细胞减少;⑤qRT-PCR检测显示,与健康组比较,牙周炎组大鼠牙龈组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达升高(P<0.05);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组、载药水凝胶组大鼠牙龈组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达降低(P<0.05);⑥结果表明,人β-防御素3水凝胶可通过降低炎症因子的相对表达及抑制破骨来减轻大鼠牙周组织炎症。

人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人 β 防御素 3 (hβD 3 )cDNA并构建其原核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA ,经RT PCR扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体进行序列测定 ,然后构建于新型原核表达载体pQE 80L中。结果 RT PCR扩增得到约 13 5bp的目的DNA片断 ,序列分析与GenBank中报道的编码hβD 3成熟肽的cDNA序列完全一致。 结论 hβD 3cDNA的克隆和原核表达载体的构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对铜绿假单胞菌(PA)形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度(M IC);扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的诱导效果基本相当。

人β-防御素3基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

以质粒pPIC9K-hBD3为模板,扩增得到一段上游带信号肽因子(α-factor)的人β-防御素-3(hBD-3)基因,克隆至酿酒酵母穿梭质粒pYES2中,构建了酿酒酵母表达载体pYES2-α-factor-hBD3(pYα-hBD3)。将重组质粒转化至Saccharomyces cerevisiaeINVSC1中,鉴定阳性重组子,经2%半乳糖诱导表达。实验发现表达所得hBD-3对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)具有明显的抑菌活性。hBD-3基因片段在酿酒酵母中的表达,为进一步探讨hBD-3的生物活性及防御素应用安全性打下基础。

人β-防御素3与杀菌/通透性增加蛋白重组腺病毒载体及其转染C3H10T1/2细胞的构建

目的构建人β-防御素3(h BD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达。方法酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到p Shuttle-CMV得到p Shuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至p Adxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液。p Adxsi-BPI-BD3及空载体p Adxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2。RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010pfu/ml。p AdxsiBPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功。MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P>0.05)。结论成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础。

人β-防御素3基因的克隆分析及其真核表达载体的构建

根据Genebank上公布的人β-防御素3基因序列设计引物,以提取的人DNA为模板进行PCR扩增,得到全长为1391bp的人β-防御素3完整基因组序列,包括起始序列、信号肽序列、2个外显子、1个内含子以及上下游酶切位点和终止密码子等。与NCBI上公布的DNA序列的同源性达到99.93%,在内含子上有1个A的缺失,其编码氨基酸序列与公布序列的同源性达100%。将其克隆到pMD18-T载体中,进一步构建了其真核表达载体pcDNA-hBD3,为其表达和功能研究奠定基础。

人β-防御素3转染脂肪干细胞成骨分化潜能及抗牙周炎致病菌的作用

目的探讨人β-防御素3(hβD-3)转染脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化潜能及体外抗牙周炎致病菌的作用。方法体外提取人腹部脂肪组织,分离后用流式细胞仪鉴定人脂肪干细胞(hADSCs)免疫表型(CD29/CD44),体外培养hADSCs,将细胞分为对照组、空载组与实验组(按hβD-3-hADSCs接种密度分为低密度组、中密度组和高密度组),对照组不作处理,空载组转染不含hβD-3基因的慢病毒载体,实验组利用质粒构建含hβD-3基因的慢病毒载体并转染hADSCs。空载组与实验组均加入成骨分化诱导液,对照组不作处理,在诱导7、14 d后,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中成骨相关基因[碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)]的表达量,以评价hADSCs的分化能力。测量抑菌圈的直径,设置抗生素阳性对照(米诺环素组、环丙沙星组),检测转染后的hADSCs对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌的抑菌活性。结果诱导7、14 d时,空载组与实验组的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);空载组与实验组诱导14 d时的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量高于诱导7 d时,差异有统计学意义(P<0.05)。葡萄球菌抑菌实验中,低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于环丙沙星组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P<0.05)。卟啉单胞菌抑菌实验中,低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于米诺环素组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论hβD-3转染可促进hADSCs成骨分化,且对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌均有较好的抗菌活性。

人β-防御素3的研究新进展及其与疾病的关系

防御素是近年来发现的一类内源性小分子多肽,人β-防御素-3(HBD-3)是在银屑病患者皮损组织中首先发现,HBD-3在人体上皮细胞和黏膜组织中广泛表达,分子结构稳定,具有广谱的抗微生物活性,能促进伤口愈合,发挥免疫调节及抗肿瘤等多种作用。HBD-3在呼吸系统疾病、消化系统疾病、囊性纤维化、肿瘤等疾病中发挥重要作用,应用前景广阔。

人β-防御素3在感染皮肤组织中表达的研究

目的:探讨人β-防御素3(hum an β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况。方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论:感染皮肤组织中hBD3的mRNA和蛋白水平均显著高于正常皮肤组织。感染皮肤组织中hBD3表达增强。

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的 :在大肠杆菌系统中表达有活性的人 β 防御素 3(hBD3)。 方法 :从pGEM T hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因 ,插入pGEX 4T 1构建pGEX 4T 1 hBD3融合表达载体 ,转化E .coliDH5α宿主菌 ,进行IPTG诱导 ,诱导菌经超声裂解后获得包涵体 ,包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST hBD3融合蛋白 ,再经凝血酶切割 ,获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果 :以与GST融合表达的方式 ,运用pGEX 4T 1系统在大肠杆菌中表达了hBD3,融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使rhBD3释放出来 ,其对金黄色葡萄球菌的MIC为 4 μg/ml;对大肠杆菌的MIC为 8μg/ml。 结论 :采用pGEX 4T 1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。

人β-防御素3在体外对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

为了更充分地阐明人β-防御素3(HBD3)对淋巴细胞增殖反应的影响,试验先用CCK-8对不同浓度的刀豆蛋白A(ConA)诱导的淋巴细胞增殖反应进行检测,进而筛选出最适ConA浓度,然后再用CCK-8检测不同浓度(1,10,100,500,1 000 ng/mL)的HBD3协同最适ConA浓度诱导淋巴细胞增殖反应。结果表明:ConA的最适浓度为2μg/mL;浓度为1,10,100 ng/mL的HBD3可以显著促进2μg/mL ConA诱导的淋巴细胞增殖反应,但是伴随着HBD3浓度的不断升高这一作用逐渐降低,当浓度为500 ng/mL和1 000 ng/mL时表现出一定程度的抑制作用。说明HBD3在一定浓度范围内对ConA诱导的淋巴细胞增殖反应具有促进作用,而超出这一浓度范围就会出现抑制作用。

人β-防御素-3对小鼠牙周炎进展的保护作用

目的:探索人β-防御素-3在小鼠牙周炎进展中的保护作用。方法:用丝线结扎法建立小鼠牙周炎模型。实验组小鼠腹腔注射人β-防御素-3(100μg/kg),另选结扎过小鼠和未结扎小鼠各1组,腹腔注射磷酸盐缓冲液为对照。8周后取上颌骨,Micro CT、HE染色、TRAP染色及免疫组化染色,评估人β-防御素-3对牙周炎进展的作用。结果:人β-防御素-3能减少牙槽骨吸收及骨内破骨细胞数量;减轻牙龈上皮棘层增厚、上皮钉突增生、炎症细胞浸润、胶原纤维变性断裂等病理变化,降低牙周组织中IL-6、MCP-1和TNF-α的表达强度。结论:人β-防御素-3能够减轻牙周组织炎症,减少牙周组织破坏,从而减缓牙周炎进展。

人β-防御素3与结缔组织生长因子共表达重组慢病毒载体的构建及表达

目的体外构建共表达人β-防御素3(hBD3)与结缔组织生长因子(CTGF)的重组慢病毒,并检测其对骨髓间充质干细胞(BMSC)的转染效率及表达情况。方法体外构建携带hBD3、CTGF和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒表达载体,测定病毒滴度。转染BMSC,确定最适感染倍数(MOI)值。采用荧光显微镜和流式细胞仪检测病毒的转染效率及传代稳定性。Western印迹检测目的蛋白的表达。结果经PCR和测序分析鉴定,成功构建了携带hBD3和CTGF基因的重组慢病毒载体Lenti-CTGF-hBD3-EGFP、Lenti-hBD3-EGFP和Lenti-EGFP,检测病毒滴度分别为3.21×10~8、5.80×10~8和1.16×10~9。病毒转染BMSC最适MOI值为150。荧光显微镜下,转染后BMSC绿色荧光效率高;流式细胞仪检测病毒的转染效率,Lenti-CTGF-hBD3-EGFP为79.72%,Lenti-hBD3-EGFP为83.08%,Lenti-EGFP为84.43%,且都稳定遗传。Western印迹显示目的蛋白表达成功。结论成功构建了共表达hBD3、CTGF的重组慢病毒载体,并能在BMSC中高效、稳定表达,为进一步研究hBD3与CTGF的应用奠定了基础。

龈沟液β-防御素-2、β-防御素-3在慢性牙周炎与2型糖尿病中的水平研究

目的通过检测龈沟液中β-防御素2、β-防御素3的表达水平,探讨其在慢性牙周病与2型糖尿病中的可能作用。方法选取慢性牙周炎伴2型糖尿病组(T2DMCP组)20例,2型糖尿病组(T2DM组)20例,慢性牙周炎组(CP组)20例,健康组(H组)20例作。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测龈沟液中β-防御素-2和β-防御素-3水平。比较组间龈沟液中β-防御素-2和β-防御素-3水平的差异性,分析β-防御素-2和β-防御素-3之间的相关性与β-防御素-2和β-防御素-3与牙周指标的相关性。结果 CP组、T2DM组、T2DMCP组的临床指标PD、CAL、BI和GCF量均高于H组(P<0.05)。T2DMCP组的PD、CAL、BI和GCF量均高于T2DM组和CP组(P<0.05)。龈沟液中β-防御素-2,β-防御素-3水平在H组高于CP组、T2DM组和T2DMCP组(P<0.05),CP组和T2DM组高于T2DMCP组(P<0.05)。龈沟液中β-防御素-2水平与β-防御素-3水平呈正相关(P<0.05)。结论慢性牙周炎和2型糖尿病可降低龈沟液β-防御素-2和β-防御素-3的水平,提示β-防御素-2、β-防御素-3对牙周组织起保护作用。

慢性扁桃体炎中人β-防御素-3的表达及意义

目的探讨慢性扁桃体炎中人β-防御素-3(hBD-3)的表达及意义。方法应用HE染色,逆转录聚合酶链式反应、SP法、蛋白印迹法观察和检测15例扁桃体炎组和10例对照组组织的病理变化及组织中hBD-3的表达。结果 HE光镜下显示对照组病理特点固有层纤维结缔组织反应性增生为主,非角化复层扁平层内未见炎性细胞浸润;扁桃体炎组淋巴滤泡增生,生发中心扩大,非角化复层扁平层内炎性细胞浸润,蛋白渗出明显。逆转录聚合酶链式反应结果显示扁桃体炎组观察到目的片段;对照组未见hBD-3的特异片段。免疫组织化学光镜下显示扁桃体炎组非角化复层扁平上皮细胞胞浆中hBD-3阳性表达;对照组非角化复层扁平上皮细胞胞浆中呈阴性表达。蛋白印迹法检测结果显示扁桃体炎组可见阳性条带;对照组未见阳性条带。结论 hBD-3在慢性扁桃炎中的表达,表明hBD-3可能在扁桃体和上呼吸道抗感染中发挥重要作用。

盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响

目的探究并分析盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响。方法选取2016年9月至2017年9月新乡医学院第一附属医院收治的100例非淋菌性宫颈炎患者,按照随机数字表法分为对照组和试验组,每组50例。对照组患者采用交沙霉素治疗,试验组患者采用米诺环素治疗。观察并记录两组患者治疗前、治疗后2周、治疗后4周HBD-1、HBD-2、HBD-3mRNA含量、治疗4周后疗效以及不良反应发生率。结果治疗前后两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA比较,组别与不同时间点的交互作用有统计学意义(F=10.432,P=0.002),两组患者组间宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA比较,差异有统计学意义(F=9.126,P=0.003),两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA不同时间点比较,差异有统计学意义(F=9.726,P=0.003),在治疗4周后试验组宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA明显比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论米诺环素能有效降低非淋菌性宫颈炎患者HBD-2,HBD-3表达,改善其治疗效果,值得临床广泛推广。

人β-防御素-3调控呼吸道合胞病毒致哮喘幼鼠的气道重塑及白细胞激活

目的:探究人β-防御素-3(hBD3)对呼吸道合胞病毒(RSV)感染诱发哮喘幼鼠气道重塑与白细胞激活的影响及其机制。方法:采用卵清白蛋白(OVA)合并RSV诱发建立幼鼠哮喘模型,期间予100μg·kg^(-1)·d^(-1) hBD3溶液灌胃;制备肺泡灌洗液(BALF),瑞氏染色测定BALF细胞总数与各细胞计数,ELISA法检测BALF和血清中免疫球蛋白IgE、白细胞介素(IL)-4、IL-5、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;HE染色、PAS染色和Masson染色观察肺组织病理学变化情况,观察切片测定各项气道重塑指标,免疫组化染色检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,蛋白质印迹法检测肺组织生长因子与自噬相关蛋白的表达。结果:相较于模型组,经hBD3作用的幼鼠BALF中细胞总数以及嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的比例均降低,BALF和血清中IgE、IL-4、IL-5、TNF-α水平均下降,肺组织损伤明显缓解,炎症细胞浸润减轻,杯状细胞减少,肺组织胶原纤维面积较小,管壁面积/气管内周长(WAt/Pi)、支气管平滑肌面积/气管内周长(WAm/Pi)及支气管平滑肌细胞核数目/气管内周长(N/Pi)均下降,α-SMA阳性表达率下降,同时肺组织中血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与Beclin-1的蛋白表达水平均下调,P62蛋白表达水平则上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:hBD3能够抑制RSV感染诱发哮喘幼鼠模型的气道炎症和气道重塑过程,介导白细胞失活,该作用可能与调控自噬水平相关。

人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达

目的:利用PCR技术对人β防御素3基因进行定点突变,将突变后的基因连接入pGEX4T1表达载体.方法:采用PCR体外定点突变技术,设计两对引物,引入一个突变点,通过重叠延伸法进行两次PCR扩增,使人β防御素3基因第27位密码子由GAG突变为CGA,将突变后的片段克隆入pGEX4T1质粒中,转化至E.coliBL21,对鉴定含有目的片段的克隆进行测序.结果:获得预期大小的突变产物,经序列鉴定证实为突变的人β防御素3基因.将诱导后的菌体进行SDSPAGE电泳,在Mr31000处可见明显的高表达带.结论:获得突变型人β防御素3基因,构建了表达载体,融合蛋白得到表达,为基因工程制备肽类抗生素奠定了基础.