人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 。

人β_2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的 :制备人β2 m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4的表达。方法 :应用显微注射将人 β2 m基因注入C5 7BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 ,出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2 m转基因的表达。结果 :6只原代仔鼠及 7只它们的下一代 (F1)带有人 β2 m基因。由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL/6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11.4% ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3.9% ) ,含有人 β2 m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性。整合的转基因均为单拷贝。Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合。阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人 β2 m转基因mRNA的表达。结论 :在转基因动物制备中 ,C5 7BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代。与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2 m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低。得到的人 β2 m转基因小鼠能够将人 β2 m基因传给下一代并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配。

含五聚结构域的重组人β_2m-GFP蛋白的构建

本研究的目的是为得到表达人MHCⅠ类分子轻链蛋白β2m、β2m的C-末端与一段五聚体(penta)序列相连、且共价结合一段荧光素编码序列(GFP)的五聚重组人β2m-GFP蛋白。采用PCR扩增GFP基因及β2m基因片段,将其克隆到原核表达载体,并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达融合蛋白。提纯重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定。结果表明,成功将GFP基因或人β2m基因片段插入含五聚结构域的PVT2载体。转化菌经诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,分子量与预期的大小基本一致。重组蛋白用Ni-NTA柱提纯,纯化蛋白的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带。Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫活性。因此,我们获得了含五聚结构域的人β2m-GFP在原核系统中的稳定表达,为后续深入研究含五聚结构域的重组MHCⅠ类分子的功能及应用奠定了基础。