重组人γ-干扰素联合白消安诱导建立小鼠重型再生障碍性贫血模型

背景:建立理想的重型再生障碍性贫血动物模型对探究再生障碍性贫血发病机制及筛选有效防治药物尤为重要。目的:应用注射用重组人γ-干扰素联合白消安建立小鼠重型再生障碍性贫血模型。方法:选择健康雌性昆明小鼠60只,随机分为再生障碍性贫血造模组(n=50)和对照组(n=10)。再生障碍性贫血造模组予重组人γ-干扰素1×104 U/d腹腔注射,以白消安18 mg/(kg·d)灌胃,均连续用药7 d;对照组给予同等容量生理盐水灌胃及腹腔注射。比较两组间一般情况、体质量及血细胞计数,并观察再生障碍性贫血造模组小鼠骨髓细胞形态学及骨髓活组织病理学的变化。结果与结论:给药第7天时,再生障碍性贫血造模组小鼠体质量、白细胞、血红蛋白、血小板及网织红细胞计数均较对照组明显下降,差异有显著性意义(P<0.05);骨髓细胞形态学及骨髓活组织病理学检查显示再生障碍性贫血造模组小鼠骨髓增生极度减低,非造血细胞团相对易见,油滴明显增多,脂肪空泡明显。提示联合应用重组人γ-干扰素和白消安能成功建立小鼠再生障碍性贫血模型,该造模方法操作简便,费用低,稳定性好。

重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ 干扰素包涵体复性条件 ,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度 ,同时对加样操作方式进行了考察 ,得到了较为适宜的复性条件 .结果表明 ,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集 ,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大 ,在 4℃、pH值 8 0、脲浓度 1 0mol·L-1、蛋白浓度0 1mg·ml-1及脉冲加样操作方式等条件下 ,复性后重组人γ 干扰素的活性为 2 39× 10 5IU·ml-1,比活达 2 2 1× 10 7IU·mg-1.

小分子伴侣协助重组人γ-干扰素体外复性研究

考察了小分子伴侣在游离和固定化两种情况下 ,对重组人γ 干扰素 (rhIFN γ)体外重折叠复性的作用 .实验结果表明 ,小分子伴侣GroEL191～ 345的加入有效地促进了rhIFN γ的复性 ,在初始蛋白质浓度为 10 0mg/L时 ,rhIFN γ复性后蛋白质回收率提高了 2 2倍 ,总活性提高了近 3倍 ;将小分子伴侣固定化在NHS activatedSepharoseFastFlow凝胶后 ,不但能重复利用 ,而且进一步提高了rhIFN γ复性效率 ,在初始蛋白质浓度为4 0 0mg/L时 ,仍使蛋白质回收率达到 4 6 2 9%和比活达到 1 95× 10 7U/mg .

人γ-干扰素基因工程菌培养条件的研究

对表达重组人γ-干扰素的基因工程菌的培养条件进行了较详细的研究.确定了最佳的培养及诱导时间,并利用正交试验设计,对影响工程菌生长和重组人γ-干扰素表达的条件如培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物的量及摇床转速、装液量、接种量、pH等进行了优化.结果表明,在优化条件下,表达的γ-干扰素包涵体占菌体总蛋白的60%以上,每升发酵液可获得包涵体约为1.6g.

离子交换层析复性重组人γ-干扰素折叠二聚体的形成

SP Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用尿素梯度法进行重组人γ-干扰素包涵体蛋白质的复性实验.结果表明,尿素梯度离子交换层析法能有效地复性重组人γ-干扰素包涵体,复性后的重组人γ-干扰素的纯度达95%,蛋白收率达54%,比活为7.5×105IU?mg-1.以Superdex 75凝胶作为体积排阻层析介质,对离子交换层析复性的样品进行分析,表明离子交换层析复性的样品中没有重组人γ-干扰素聚集体存在.荧光光谱分析表明重折叠的重组人γ-干扰素的构象接近于其天然二聚体构象.

重组人γ-干扰素纯化工艺的建立

采用超声破碎的方法提取hIFN-γ包涵体,经盐酸胍溶解、稀释复性、浓缩后通过SPSepharose F.F层析纯化,简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。SDS-PAGE检测表明,hIFN-γ纯度达97%,比活性为3.5×107IU/mg,总回收率达40%。说明整个工艺适合于大规模生产的要求,具有实际应用价值,为hIFN-γ批量生产奠定了良好的基础。

重组人γ-干扰素基因工程菌发酵工艺优化

研究不同类型培养基、诱导时间、菌体密度和不同补料对rhIFN-γ表达的影响,并运用高密度发酵工艺对rhIFN-γ的产量进行优化,目的蛋白表达量从4 000 mg/L提高到20 000 mg/L以上,发酵产量提高了5倍,大大提高了效率。同时为验证工艺的稳定性,将优化的发酵条件进行连续三批重复发酵实验。结果表明该优化条件具有重复性,表达稳定,维持在40%左右,从而为rhIFN-γ大规模生产奠定了良好的基础。

重组人γ-干扰素摇瓶生产工艺优化

通过研究不同类型培养基和培养温度、起始pH值等发酵条件对rhIFN-γ产量的影响,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,优化的发酵条件为发酵起始pH值7.0、培养温度37℃、IPTG诱导浓度1.0 mmol/L、菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG、诱导时间为3 h。此时rhIFN-γ产量达到最高水平,从而为rhIFN-γ批量生产奠定了良好的基础。

脲梯度扩张床吸附层析复性重组人γ-干扰素

针对固定床吸附层析技术用于蛋白质体外重折叠复性时,折叠聚集中间体易聚集造成床层堵塞等问题,将扩张床吸附层析技术应用于重组人γ-干扰素包涵体蛋白质的复性研究,并与脲浓度线性梯度法相结合,考察了脲梯度长度和脲终浓度对重组人γ-干扰素复性的影响.复性后的重组人γ-干扰素的纯度达90%;较长的脲梯度长度和合适的脲终浓度有利于蛋白质的复性;在较优的实验条件下,复性后的重组人γ-干扰素收率为53.7%,比活达9.75×106IU/mg.脲梯度扩张床吸附层析法具有处理量大的优点,能有效地复性重组人γ-干扰素包涵体,并能实现复性和分离包涵体蛋白质过程的集成化.

摇瓶中重组大肠杆菌生产人γ-干扰素工艺优化

目的优化大肠杆菌生产重组人γ-干扰素摇瓶发酵工艺条件，分析摇瓶发酵过程中的制约因素。方法在摇瓶中研究了种子菌龄、接种量和诱导时机等因素对工程菌生产rhlFN-γ和质粒稳定性的影响，及优化条件下工程茵发酵参数。结果最佳条件：种子液为OD6000．5—1．5，接种量为6％，培养至OD600为1．5时42℃诱导表达4h。在此条件下，在摇瓶中使用M9II培养基时，质粒无丢失，摇瓶中rhlFN-γ的表达量占菌体总蛋白的43．2％，光密度为3．3。对发酵过程中总糖、还原糖、总氮和pH的分析表明，发酵过程中培养基中碳源、氮源丰富，而溶解氧的不足和pH值偏酸性可能是整个培养过程的限制性因素。结论构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好，为rhlFN-γ的大规模生产提供可靠的放大依据。

人γ-干扰素研究进展

本文不仅综述了人γ-干扰素(hIFN-γ)分子结构的多态性,而且简介了表达载体的构建、表达和表达产物的纯化等技术方法,并对现存的问题和前景作了简要分析。

人γ-干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ干扰素产生菌ＳＷＩＮＦ／ＤＨ５α并成功地获得高表达、高产量的菌体，表达的γ干扰素蛋白占菌体总蛋白的６０％以上，２０Ｌ发酵液可收获２ｋｇ（湿重）菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００柱的纯化方法，简化了纯化步骤，缩短周期，提高了蛋白回收率。纯化中未采用单抗亲和层析技术，使产品更为安全可靠。最终产品经ＳＤＳＰＡＧＥ检测纯度达１００％，核酸含量和热原均合格，Ａ２８０／Ａ２６０＞１５，比活性达１×１０７ＩＵ／ｍｇ，总回收率达４０％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要，具有实际应用价值。

人γ-干扰素基因在大肠癌细胞中的表达研究

目的探讨γ 干扰素用于基因治疗的有效途径。方法将人γ 干扰素 (huIFN γ)全长cDNA经序列测定后克隆到真核表达质粒pcDNA 3中 ,构建真核表达质粒pcDNA 3 IFN γ ,利用阳离子脂质体Lipofectamine介导转染人大肠癌细胞 ,用PCR、RT PCR对该基因的整合和表达进行鉴定 ,并对细胞培养上清中γ 干扰素的活性进行检测。结果该基因已经有效地进入细胞内并实现了表达。结论利用脂质体可以有效地将huIFN γ基因导入肿瘤细胞内 ,并获得稳定表达。

重组人γ-干扰素对移植于裸鼠的人增生性瘢痕的作用

目的 探讨γ 干扰素对人增生性瘢痕的疗效。方法 将人增生性瘢痕移植于裸鼠后 ,在瘢痕内注射γ 干扰素 ,共 8次。 4周后 ,对瘢痕进行外观及组织学观察 ,同时测定胶原及羟脯氨酸含量的变化。结果 ①局部用γ 干扰素组较对照组瘢痕变平 ;光镜下 :紊乱的胶原束变薄 ,变直 ,结节不明显或消失 ;透射电镜下 :成纤维细胞功能活动受抑 ,由活跃状态变为非活跃状态。②治疗组增生性瘢痕组织中胶原及羟脯氨酸含量较对照组减少。结论 γ 干扰素对增生性瘢痕有抑制作用 ,可考虑在临床观察试用。

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。

疏水层析法复性重组人γ干扰素

重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析(HIC)法对rhIFN-γ进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6mol·L-1下降到2mol·L-1,流速为1ml·min-1、上样量为0.568mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×108IU·mg-1.

基因工程菌发酵实验中培养基优化的数学模型

本文对重组人γ-干扰素的发酵培养基组分进行了数值研究.采用逐步回归技术并应用统计软件SAS对实验数据进行回归分析,建立了重组人γ-干扰素的产量同培养基组分之间的数学模型,并得出了最佳培养基的配方组成.为基因工程菌的发酵实验提供了可靠的理论依据.