重组人Ⅲ型胶原蛋白的分离纯化

利用分泌表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母发酵液,通过层析条件的优化,建立了重组人Ⅲ型胶原蛋白一步层析纯化工艺。发酵液以硫酸铵(30%饱和度)沉淀胶原蛋白,沉淀用超纯水复溶后超滤转换介质至20 mmol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer,PB)(pH 6.0),然后用SP Sepharose HP阳离子交换柱进行纯化,以20mmol/L PB (pH 6.0)-150 mmol/L NaCl洗涤杂蛋白,以20 mmol/L PB (pH 6.0)-250 mmol/L Na Cl洗脱重组人Ⅲ型胶原蛋白。采用该工艺对60 L发酵液进行重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化,产品纯度97.7%,总回收率68.8%,纯化的重组人Ⅲ型胶原蛋白纯度高,热原含量低,可用于医药领域。该研究建立了一步层析法从毕赤酵母发酵液中高效制备重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化工艺,工艺简便、稳定可靠,离子交换层析放大容易,为重组人Ⅲ型胶原蛋白的工业化生产奠定了基础。

甲醇浓度对毕赤酵母发酵表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的影响

目的:探讨不同浓度甲醇对毕赤酵母发酵表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的影响,以寻找最佳甲醇浓度,从而提高毕赤酵母分泌表达人Ⅲ型胶原蛋白的产量。方法:在15升发酵罐中研究了毕赤酵母表达重组人Ⅲ型胶原蛋白时的甲醇浓度。在通气量、搅拌转速最大的情况下,通过控制流加甲醇量,利用甲醇传感器在线检测不同甲醇浓度(0.05%、0.1%、0.2%、0.4%)对毕赤酵母高密度发酵表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的影响。结果:经优化后甲醇浓度维持在0.2%时,胶原蛋白表达量达从3 g·L-1提高到8 g·L-1。结论:控制甲醇恒定的浓度可明显提高胶原蛋白的表达量。

新型生物医用材料A型重组Ⅲ型人源化胶原蛋白

胶原蛋白是人体重要的细胞外基质成分,具有着特殊的“三螺旋”结构,既是结构蛋白又是功能蛋白,也是 重要的生物医用材料。目前市场主流的胶原蛋白主要是通过动物组织提取获得,无法避免种属差异带来的免疫原 性及动物病原体风险,同时,低丰度胶原蛋白无法通过动物组织提取获得。利用合成生物制备重组胶原蛋白是胶 原蛋白产业发展趋势,尤其是通过功能区策略制备的重组人源化胶原蛋白,不仅能够避免免疫原性,还可保障胶原 良好的生物相容性与活性。本文重点介绍山西锦波生物医药股份有限公司 A 型重组Ⅲ型人源化胶原蛋白新材料 的研发历程,同时分析其可能的创新应用场景。首先,通过高通量筛选获得具有 164. 88°特殊三螺旋结构的人Ⅲ型 胶原蛋白核心功能区。随后对该功能区进行 16 次线性重复,获得 A 型重组Ⅲ型人源化胶原蛋白,其氨基酸序列中 无任何外源非人胶原蛋白序列。经多种方法检测,其具有三螺旋结构,与细胞互作时不进入细胞,通过改善细胞外 基质,有效发挥修复再生功效,有望在皮肤损伤修复、妇科、心血管科、骨科、口腔科等领域发挥重要作用。目前,其 在重组胶原注射领域占据主要市场地位,突破 40 年仅有动物胶原注射的时代。

局部应用重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶对糖尿病患者创面愈合的影响

目的探讨局部应用重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶治疗糖尿病合并下肢难愈性创面的效果及其对创面炎症反应的影响。方法选择2020年9月至2021年6月北京市化工职业病防治院医疗部收治的糖尿病合并下肢难愈性创面患者20例作为研究对象,采用随机数字表法分为试验组与对照组,每组各10例。在实施基础抗糖尿病治疗基础上,试验组局部外敷重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶,对照组给予常规清创换药治疗,比较2组创面愈合率及创面组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平。结果2组患者治疗后创面面积均较治疗前缩小,试验组患者治疗后7、14 d的创面愈合率分别为(34.00±2.53)%、(73.90±13.00)%,明显高于对照组(23.30±3.89)%、(48.30±6.30)%,差异均有统计学意义(t=1.330、2.640,P<0.05);治疗后14 d,2组患者创面中TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9水平较治疗前均降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且试验组患者创面中TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9的含量[(87.60±8.78)、(71.70±10.30)、(79.80±13.60)、(11.27±2.45)ng/L]均分别低于对照组[(111.60±9.86)、(81.10±8.03)、(96.90±14.50)、(15.05±2.82)ng/L],差异均有统计学意义(t=-5.740、-2.260、-2.720、3.200,P<0.05)。结论局部应用重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶治疗糖尿病合并下肢难愈性创面,可有效提高创面愈合率,降低创面炎症反应,临床治疗效果显著。

重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶对猪全层皮肤缺损创面修复的影响

目的观察重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶用于治疗猪全层皮肤缺损创面,在创面愈合和血管新生,新生真皮胶原排列状态和胶原比例等方面的影响。方法将重组人Ⅲ型胶原蛋白粉末与海藻酸钠粉末以质量比10∶1混合,溶于无菌磷酸盐缓冲液中,制备成胶原蛋白含量为10%的溶液,使用时以10%Ca2+溶液交联成凝胶状。以巴马小型猪作为实验动物制备动物模型,在每头猪背部正中线两侧旁开2 cm分别用手术刀制备3个边长5 cm深达肌肉筋膜的正方形全层皮肤缺损创面,采用同体自身对照,实验组用重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶治疗,水凝胶外层覆盖无菌硅胶膜保湿;阳性对照组用可吸收性敷料治疗;阴性对照组仅用无菌硅胶膜覆盖。术后7、14、21、90 d,进行创面大体观察,并取材行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察创面修复情况、炎症反应,免疫组织化学染色法检测创面CD31的表达并计数新生血管数目,天狼猩红饱和苦味酸染色偏振光观察胶原纤维排列、Ⅲ型胶原蛋白比例。实验数据比较采用单因素方差分析、SNK-q检验或Kruskal Wallis H检验。结果实验组创面肉芽组织平整,颜色鲜红,柔软湿润。光学显微镜下见实验组较阴性对照组组织炎症反应轻微,创面修复早期肉芽组织生长速度快。CD31免疫组织化学染色结果显示,术后7、14、21 d,实验组新生毛细血管数分别为(18. 8±2. 7)、(32. 0±4. 4)、(42. 8±4. 5)个/hpf,而阴性对照组仅分别为(12. 0±3. 0)、(16. 6±2. 3)、(12. 6±4. 1)个/hpf,各个时间点实验组新生毛细血管数均高于阴性对照组,差异均有统计学意义(P值均小于0. 05)。术后14、21、90 d创面新生真皮组织天狼猩红饱和苦味酸染色结果显示,实验组较阴性对照组胶原纤维排列规整,与阳性对照组相似,而Ⅲ型胶原蛋白比例较阴性和阳性对照组均升高。结论重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶可促进全层创面愈合和血管新生,促进新生真皮组织胶原纤维有序排列,增加Ⅲ型胶原在新生真皮胶原中所占比例,从而改善创面愈合质量,并有望减轻创面愈合后的瘢痕形成。

重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达纯化及性能研究

目的表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白(rhCol),并评价其性能。方法构建重组基因工程菌pET30a(+)-1880/pACYCDuet-hy726/BL21(DE3),稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhCol的纯度,全自动蛋白质多肽测序仪测定rhCol的N端氨基酸序列,紫外分光光度法测定rhCol中的羟脯氨酸含量,噻唑蓝法评价rhCol的细胞相容性。结果高密度发酵最终菌体湿重约200 g/L,表达量约3 g/L,通过亲和层析获得的rhCol的纯度大于95%。rhCol的羟脯氨酸含量为11.44%,其水溶性及细胞相容性良好。结论本研究制备的rhCol可作为一种优良的生物材料广泛用于皮肤护理及生物医药等领域。

重组人源Ⅲ型胶原蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化工艺

通过基因工程法优化人胶原蛋白的密码子序列,以人Ⅲ型胶原蛋白α1链为模板,(Gly-X-Y)为最小研究单位,构建重组质粒pET30a(+)-3CH,利用Escherichia coli发酵和蛋白纯化技术制备重组人Ⅲ型胶原蛋白(Recombinant human type Ⅲ collagen,RHCⅢ).研究结果证实,RHCⅢ的表达量为3.5 g/L,利用亲和/离子交换层析工艺纯化后的RHCⅢ纯度为95.44%,RHCⅢ蛋白溶液在4℃下可以保存12个月,稳定性良好,无细胞毒性,为重组人胶原蛋白产业化奠定了良好基础.