趋化因子受体CX3CR1调控人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用研究

目的:探究趋化因子受体CX3CR1调控人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用和机制,为钙化性主动脉瓣膜疾病的早期干预和治疗提供新思路。方法:取非钙化主动脉瓣(3例)和钙化主动脉瓣(5例),免疫组织化学染色检测成骨相关转录因子Runx2、骨桥蛋白OPN和骨钙蛋白OCN的表达;取3例非钙化的主动脉瓣,采用胶原酶连续消化法分离人主动脉瓣膜间质细胞,观察细胞形态及生长状态,并采用细胞免疫荧光进行表型鉴定。对成骨诱导培养的人主动脉瓣膜间质细胞分别过表达和干扰趋化因子受体CX3CR1,平行设置CM组、OM组和negative control+OM组,采用qPCR和Western blot检测Runx2、OPN和OCN的表达,Western blot检测AKT和p-AKT的表达。茜素红S染色评价晚期钙结节形成情况。结果:临床标本显示钙化的主动脉瓣较非钙化的主动脉瓣高表达CX3CR1(P <0. 05);成功分离人主动脉瓣膜间质细胞,α-SMA和Vimentin阳性,vWF阴性。与CM、OM、negative control组比较,CX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达上调(P <0. 05),且茜素红S染色可见明显钙结节;与CM、OM、negative siRNA control+OM组比较,si CX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达下调(P <0. 05),且茜素红S染色可见钙结节减少。结论:趋化因子受体CX3CR1可能通过AKT信号通路促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化。

应用人骨髓间质干细胞与脱细胞猪主动脉瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:应用动物来源的细胞构建组织工程化心脏瓣膜的研究较多,本实验特征在于观察人骨髓间质干细胞与脱细胞猪主动脉瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜,并探讨其作为种子细胞的可行性。方法:实验于2005-12/2006-10在解放军第二军医大学长海医院全军胸心外科研究所完成,研究方案获伦理委员会批准。①实验材料:取开胸术中切除的肋骨骨髓,术前已经患者知情同意。新鲜猪心脏瓣膜取自上海复新屠宰场。②实验方法:Ficoll密度梯度离心从肋骨骨髓中获取骨髓单个核细胞,体外扩增培养后鉴定。采用去污剂和酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理,种植人骨髓间质干细胞。③实验评估:采用EnVision二步法染色鉴定人骨髓间质干细胞形态及细胞表型;采用苏木精-伊红染色、维多利亚蓝染色和VanGieson氏染色法观察细胞在脱细胞猪主动脉瓣叶支架上的生长特点;扫描电镜观察静态构建组织工程心脏瓣膜的形态。结果:①人骨髓间质干细胞形态及细胞表型鉴定:人骨髓间质干细胞为梭形,抗平滑肌抗体和波形蛋白染色阳性,CD31及Ⅷ因子染色阴性。②脱细胞猪主动脉瓣膜支架的组织学观察:猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整,种植的人骨髓间质干细胞在脱细胞瓣叶表面形成完整的细胞层。③构建组织工程心脏瓣膜的形态学观察:扫描电镜示瓣膜表面细胞层完整,细胞呈梭形复层生长。结论:人骨髓间质干细胞体外具有自然分化为肌成纤维细胞的特性,在去细胞猪主动脉瓣膜上生长良好,可作为一种有前途的种子细胞构建组织工程心脏瓣膜。

基于内质网应激的丹参酮ⅡA磺酸钠调节主动脉瓣膜间质细胞钙化机制研究

目的:研究丹参酮IIA磺酸钠对低密度脂蛋白(ox LDL)诱导的猪主动脉瓣膜间质细胞(porcine valvular interstitial cells,VICs)钙化模型内质网应激(ERS)因子作用的影响。方法:分离VICs免疫荧光法鉴定细胞,应用ox LDL建立细胞模型,MTT法筛选最佳丹参酮IIA磺酸钠干预浓度,茜素红染色测量钙化结节,免疫印记法及实时荧光定量PCR法检测ERS通路中BIP、Chop、Runx2及Osteocalcin蛋白及基因表达,ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子表达,应用MCP-1中和抗体观察MCP-1在成骨化中的作用。结果:在成功建立ox LDL诱导的VIC细胞模型基础上,茜素红染色显示丹参酮IIA磺酸钠组钙结节形成较ox LDL模型组差异有统计学意义;丹参酮IIA磺酸钠可抑制BIP、Chop细胞内基因的表达,抑制Runx2及Osteocalcin蛋白表达,同时可抑制IL-6、IL-8及MCP-1炎症因子的表达,其表达与模型组比较差异有统计学意义,但MCP-1中和抗体对成骨化因素影响较小。结论:丹参酮IIA磺酸钠可抑制ox LDL诱导的VIC炎症反应及成骨化,其具体机制可能与抑制ERS通路有关。

钙化性主动脉瓣疾病瓣膜间质细胞的生物学特征分析

目的初步分析钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)瓣膜间质细胞的生物学特征,为后续研究奠定基础。方法采用组织块接种和免疫磁珠法分选正常主动脉瓣和CAVD瓣膜间质细胞,观察其形态学和行为学特征。通过免疫细胞化学染色和流式细胞术分析CAVD瓣膜间质细胞免疫表型的改变。结果与正常主动脉瓣瓣膜间质细胞相比,CAVD瓣膜间质细胞呈肌纤维母细胞和成骨细胞形态,当细胞达到一定密度后细胞自发性收缩、聚集样生长并形成钙化结节。体外培养的CAVD瓣膜间质细胞表达肌纤维母细胞标志物α-SMA和成骨细胞标志物碱性磷酸酶(ALP)。结论 CAVD瓣膜间质细胞生物学特征的改变可能是导致主动脉瓣增厚、钙化和交界融合的重要因素。

雷帕霉素对大鼠主动脉瓣膜间质细胞增殖的影响

目的利用雷帕霉素靶向抑制m TOR并探讨其对大鼠心瓣膜间质细胞增殖的影响。方法体外分离大鼠瓣膜间质细胞后培养并鉴定;细胞随机分为两组:雷帕霉素组与对照组;MTT法检测并绘制大鼠瓣膜间质细胞用药前后的生长曲线;流式细胞仪检测雷帕霉素对细胞周期的影响;RT-PCR检测细胞中S6、P70S6K的m RNA表达水平;Western blotting检测细胞中S6、P70S6K、P-S6、P-P70S6K蛋白的表达水平。结果体外分离获得的大鼠瓣膜间质细胞分离培养成功;对照组细胞活性显著高于加药组细胞(P<0.05),加药组细胞生长变缓。流式细胞术检测发现加药组和对照组细胞的各周期占比均没有明显差别;加药组细胞的S6蛋白与P70S6K蛋白的磷酸化水平降低(P<0.05)。结论雷帕霉素能抑制瓣膜间质细胞的增殖其原因,可能不是通过改变细胞周期而是通过抑制m TOR后下调其靶蛋白S6和P70S6K的磷酸化水平引起的。

白细胞介素17促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化

目的研究白细胞介素17（IL-17）是否促进主动脉瓣膜钙化形成及其可能机制。方法利用体外主动脉瓣膜间质细胞培养技术,瓣膜间质细胞培养传代3-5次后,采用简单随机抽样法分为两组：（1）对照组,细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液;（2）实验组,细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液和IL-17（50 ng/ml）。继续孵育48 h后,用细胞茜素红钙染色检测两组瓣膜间质细胞钙化情况,用Western blot和RT-PCR检测两组瓣膜间质细胞碱性磷酸酶（ALP）及骨形态蛋白2（BMP-2）的表达情况。结果实验组细胞中明显钙结节形成,对照组细胞中少量钙结节形成;与对照组比较,实验组细胞ALP和BMP-2蛋白（0.741±0.063比0.184±0.032;0.900±0.060比0.396±0.030,均为P〈0.01）与基因（0.236±0.004比0.106±0.003;0.523±0.052比0.194±0.047,均为P〈0.01）表达量均明显升高。结论 IL-17可促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。

人主动脉瓣膜间质细胞模型的建立及表型鉴定

目的 探讨一种体外分离、扩增人主动脉瓣膜间质细胞的方法并进行表型鉴定,建立研究主动脉瓣疾病的体外实验细胞模型.方法 选取在北京协和医院接受手术治疗的急性Stanford A型主动脉夹层患者5例,其中男性3例,女性2例,年龄43～ 55岁,平均（49.4±4.5）岁,术中取其正常主动脉瓣膜组织,采用改进的胶原酶消化法分离并体外扩增人主动脉瓣膜间质细胞,对原代培养细胞采用波形蛋白（Vimentin）染色及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色进行表型鉴定.结果 改进的胶原酶消化法可成功分离并体外扩增瓣膜间质细胞,体外原代培养的人主动脉瓣膜间质细胞,波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色阳性.结论 改进的胶原酶消化法可成功建立人主动脉瓣膜间质细胞体外实验细胞模型,细胞表型鉴定证实其达到实验要求,从而为从细胞水平研究退行性主动脉瓣疾病的发病机制奠定了基础.

酸碱环境变化对主动脉瓣瓣膜间质细胞钙化的影响及机制探讨

目的:研究酸碱环境变化对主动脉瓣瓣膜间质细胞钙化的影响,并探讨其机制。方法:将主动脉瓣瓣膜间质细胞分为4组进行培养:A组普通培养基,pH7.4;B组普通培养基+钙化培养基,pH7.1;C组普通培养基+钙化培养基,pH 7.4;D组普通培养基+钙化培养基,pH 7.7。

荜茇明碱抑制BMP2/pSmad1/5信号减轻高钙高磷诱导的主动脉瓣膜间质细胞钙化

目的:探究荜茇明碱对高钙高磷诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cell,AVIC)钙化的保护作用及其机制。方法:体外培养原代猪AVIC,通过高钙高磷诱导钙化并给予不同浓度荜茇明碱处理16 h后,流式细胞仪分析检测凋亡水平;AVIC在高钙高磷条件下,以2.5 mmol/L荜茇明碱或100 ng/mL骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)处理,通过检测钙浓度、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、茜素红染色反映钙化程度;Western blot、real-time PCR检测成骨相关蛋白和m RNA的表达。结果:①流式细胞分析发现,高钙高磷条件下,荜茇明碱低于5 mmol/L无明显促凋亡作用;②钙浓度、ALP活性、茜素红染色显示,2.5 mmol/L荜茇明碱显著抑制高钙高磷诱导的AVIC钙化;③Western blot、real-time PCR显示,2.5 mmol/L荜茇明碱抑制BMP2、p Smad1/5、RUNX2蛋白和mRNA的表达;④外源性重组BMP2可逆转荜茇明碱抗钙化的作用。结论:荜茇明碱通过抑制BMP2/pSmad1/5/RUNX2信号,减轻高钙高磷诱导的AVIC钙化。

LPS诱导主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用及机制研究

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导猪主动脉瓣膜间质细胞(porcine aortic valve interstitial cells,PVICs)成骨分化过程中的作用与机制。方法体外分离并培养PVICs。应用LPS诱导PVICs成骨分化,ALP染色和茜素红S染色检测细胞成骨分化能力;RTqPCR法检测细胞成骨相关基因及蛋白Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的转录水平。Western blot法检测TGF-β1、TGF-βR、Bax、Smad2/3和ERK1/2的蛋白表达水平。同时应用ERK特异性抑制剂PD98059处理,观察ERK、Bax、Runx2蛋白表达水平。结果①LPS(4μg/mL)处理可以使PVICs的碱性磷酸酶活性明显升高,钙盐沉积明显增强。②RT-qPCR检测结果显示:LPS(4μg/mL)处理后可以明显上调Runx2、OPN和OCN的mRNA转录水平(P<0.01)。③Western blot检测结果显示:LPS(4μg/mL)处理后TGF-β1、TGF-βR、Smad2/3及ERK1/2蛋白水平显著升高(P<0.05);ERK特异性抑制剂PD98059可以减弱LPS对ERK、Bax、Runx2的促表达作用(P<0.05)。结论LPS可能通过激活TGF-β1/Smads和ERK信号通路诱导主动脉瓣膜间质细胞成骨分化。

核因子-κB在主动脉瓣膜间质细胞钙化进展中的变化

目的探讨核因子-κB(NF-κB)在体外培养离体的公猪主动脉瓣膜间质细胞(AVIC)钙化过程中表达的变化。方法体外培养公猪AVIC,镜下观察其形态,应用免疫荧光染色法对AVIC进行鉴定。将AVIC分为对照组和实验组,对照组AVIC在标准培养基中培养2周,实验组AVIC在钙化诱导液中培养2周。光学显微镜下对钙化结节行茜素红染色,并进行计数;应用Western blot检测2组AVIC中NF-κB蛋白表达水平。结果成功分离并体外培养了离体的公猪AVIC,免疫荧光结果显示,α-平滑肌肌动蛋白及波形蛋白染色阳性,血管性血友病因子染色阴性。实验组AVIC自发形成钙结节数及AVIC中NF-κB表达水平均较对照组显著增高(P<0.05)。结论钙化后公猪AVIC中NF-κB表达水平增高,NF-κB可能与主动脉瓣膜钙化的发生有关。

4-苯基丁酸对同型半胱氨酸诱导的主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用及机制

目的探讨内质网应激(ERS)分子伴侣4-苯基丁酸(4-PBA)在同型半胱氨酸(Hcy)诱导的主动脉瓣膜间质细胞(AVICs)成骨分化中的作用及相关机制。方法原代SD大鼠AVICs分离与培养,前钙化培养基(PCM)诱导钙化,为明确Hcy是否诱导AVICs钙化,先采用随机数字法将AVICs分为3组:对照(NC)组,PCM组,PCM+Hcy组;为进一步明确ERS抑制剂4-PBA是否能抑制Hcy诱导的AVICs钙化,采用随机数字法将AVICs分为4组:PCM+Hcy组,4-PBA组,PCM+4-PBA组,PCM+Hcy+4-PBA组。为明确4-PBA是否能通过促进自噬,从而缓解Hcy诱导的AVICs钙化,采用随机数字法将AVICs分别分为NC组,PCM组,PCM+Hcy组;PCM+Hcy组,PCM+Hcy+4-PBA组;PCM+Hcy+4-PBA组,PCM+Hcy+4-PBA+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。Western blot检测内质网跨膜蛋白[蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子6(ATF6)]、成骨因子[Runt相关转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)]、自噬效应蛋白(Beclin1)的蛋白表达;茜素红染色测量钙化结节。结果在成功建立AVICs钙化模型基础上,茜素红染色显示PCM+Hcy组钙化结节形成较PCM组明显增多,PCM+Hcy组在PCM组基础上进一步上调内质网跨膜蛋白及成骨因子的表达,抑制了自噬;而4-PBA处理后则抑制了Hcy诱导的AVICs成骨分化,促进了自噬;在4-PBA基础上加入自噬抑制剂3-MA后,成骨分化抑制效应被逆转。结论Hcy能促进AVICs成骨分化,而4-PBA可通过抑制ERS,促进自噬,从而延缓Hcy诱导的AVICs成骨分化。

骨化三醇对脂多糖诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响

目的探究骨化三醇[1α,25-dihydroxycholecalciferol,1,25 (OH)_2D_3]对脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响,为钙化性主动脉瓣膜病的预防提供理论依据。方法 6只雄性健康家猪(8～10月龄,体质量100～120 kg),处死后即刻于无菌条件下取主动脉瓣叶。胶原酶连续消化法分离主动脉瓣膜间质细胞,观察其形态特征,并用免疫荧光染色行表型鉴定。利用条件培养基诱导细胞成骨分化,建立体外主动脉瓣膜间质细胞钙化模型,并予加入不同浓度骨化三醇处理72 h,并设立空白对照组和DMSO载体对照组。LPS诱导细胞成骨分化,筛选最适LPS效应浓度;实验分:空白对照组,骨化三醇组,LPS组,骨化三醇+LPS组。1 nmol/L骨化三醇与100 ng/mL LPS先后共同处理细胞48 h。分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞成骨分化标志物骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)的mRNA和蛋白水平表达;茜素红染色评估晚期钙结节形成情况。结果成功分离出原代猪主动脉瓣膜间质细胞,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及波形蛋白(vimentin)染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。骨化三醇抑制条件培养基诱导的细胞成骨分化,BMP-2和OC的表达较空白对照组和DMSO载体对照组均显著降低(P <0. 05)。LPS处理后可促进细胞成骨分化,与其他浓度LPS组比较,其中100 ng/mL LPS组,BMP-2和OC的表达量最多(P <0.05);加入骨化三醇预处理后,可减弱LPS诱导的细胞成骨分化标志物表达,骨化三醇+LPS组BMP-2(n=3,1.94±0.27、0.41±0.03)和OC(n=3,0.21±0.04、0.44±0.03)的表达较LPS组(2.54±0.36、0.88±0.02;2.49±0.53、0.86±0.02)明显降低(P<0.01),并且晚期钙结节形成减少。结论骨化三醇可抑制条件培养基及LPS诱导的主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,可能对主动脉瓣膜钙化具有一定的保护作用。

阿维来司他对主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用及机制研究

目的:探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)抑制剂阿维来司他(alvelestat;又称AZD9668)对猪主动脉瓣膜间质细胞(VICs)成骨分化的作用及其潜在机制。方法:收集3例患钙化性主动脉瓣膜疾病(CAVD)和1例非CAVD患者的瓣膜组织,采用免疫组织化学染色和Western blot检测NE、骨桥蛋白(OPN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达。分离猪主动脉VICs,采用细胞免疫荧光染色进行表型鉴定。MTT法检测alvelestat对VICs活力的影响。将对数生长期的VICs分为正常对照组(blank组)、成骨培养液(OM)组及OM+5、10、20和40 nmol/L alvelestat组。采用Western blot、碱性磷酸酶染色和茜素红染色等方法检测早期纤维化指标α-SMA和I型胶原(collagen I),晚期成骨分化指标OPN和RUNX2,以及NE的水平;Western blot检测alvelestat对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的作用情况,并设置blank组、OM组、OM+alvelestat组及OM+PD98059(ERK1/2抑制剂)组,检测NE、OPN和RUNX2的表达。结果:钙化的瓣膜组织中NE、OPN、RUNX2、α-SMA及pERK的表达上调(P<0.05)。分离出的猪主动脉VICs中α-SMA及vimentin阳性,CD31阴性;40 nmol/L以上的alvelestat影响VICs的活力(P<0.05);40 nmol/L alvelestat可显著抑制纤维化指标α-SMA和collagen I,成骨分化指标RUNX2和OPN,以及NE的表达(P<0.05);碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,alvelestat可以抑制成骨诱导的VICs早期和晚期钙盐沉积;alvelestat降低VICs中ERK1/2的磷酸化水平(P<0.01),且alvelestat和ERK1/2抑制剂PD98059均能降低钙盐诱导的NE、RUNX2及OPN蛋白表达(P<0.05)。结论:NE抑制剂alvelestat通过抑制成骨诱导的NE和ERK1/2信号通路而抑制VICs的成骨分化。

瘦素对主动脉瓣膜间质细胞表型转化的影响

目的 :探讨瘦素对主动脉瓣膜间质细胞(valvular interstitial cells,VICs)表型转化的影响,揭示瘦素在钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic value disease,CAVD)发生发展中所扮演的角色。方法:胶原酶消化法分离并培养猪主动脉瓣膜间质细胞,采用含不同浓度的瘦素分别刺激细胞24 h,检测细胞裂解液碱性磷酸酶(ALP)活性,并确定最佳刺激浓度。用最佳刺激浓度的瘦素刺激细胞24 h,提取细胞RNA以及蛋白,通过RT-PCR以及Western blot分别测定肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果:瘦素刺激导致ALP表达上调且最大刺激浓度为100 ng/m L。相较于对照组,瘦素刺激组OPN mRNA及蛋白表达增高,而α-SMA表达无明显变化。结论:瘦素能够诱导VICs向成骨细胞分化,从而促进VICs钙化。

人主动脉瓣间质细胞原代培养及体外钙化模型的建立

目的原代培养人主动脉瓣间质细胞并建立体外瓣膜细胞钙化模型,诱导人主动脉瓣间质细胞向成骨细胞分化,并观察其表型变化。方法采用胶原酶两次消化法原代培养人主动脉瓣间质细胞,取传代3～7代间质细胞,随机分为2组,实验组以钙化诱导培养基培养,对照组以标准培养基培养。1周后,行von Kossa染色观察钙化结节形成情况,分光光度计测定碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色检测瓣膜间质细胞表型蛋白,real-time PCR及蛋白质印迹分析检测成骨相关因子的表达,评价模型建立情况。结果培养1周后实验组出现钙化结节,每孔钙化结节数量[(51.20±14.31)个]高于对照组[(3.60±1.82)个],差异有统计学意义(P<0.05),同时实验组碱性磷酸酶活性较对照组升高(约上升4倍,P<0.05),细胞收缩表型平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增高。Real-time PCR及蛋白质印迹分析提示,实验组中成骨相关因子Runx2、osteocalcin及osteopontin在mRNA及蛋白水平均较对照组升高,磷酸化Smad1/5/8蛋白表达也同时升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了人主动脉瓣间质细胞体外诱导钙化模型,诱导后间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,为今后实验提供了可靠的细胞模型。

瓣膜间质细胞异质性在钙化性主动脉瓣疾病中的作用

钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)是一种表现为主动脉瓣增厚、钙化的疾病,随病情发展可出现瓣膜硬化,进而引起一系列血流动力学的异常改变,最终可导致慢性心力衰竭和死亡。主动脉瓣膜间质细胞是构成主动脉瓣膜的主要细胞亚群,在CAVD的发生发展中起重要的作用。当前,单细胞测序等技术让研究者对间质细胞的起源、表型和功能异质性有了新的理解。文章对间质细胞的异质性在钙化性主动脉瓣疾病中所起的作用进行综述,为靶向间质细胞延缓CAVD进程提供新的思路。

GLP-1抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)对主动脉瓣间质细胞(valve stromal cells,VIC)钙化的影响,揭示GLP-1在钙化性主动脉瓣疾病(calcified aortic valve disease,CAVD)发生发展中的保护作用及作用机制。方法:胶原酶消化法分离并培养猪主动脉瓣膜间质细胞,用高钙、高磷法刺激建立主动脉瓣间质细胞钙化模型。采用不同浓度的GLP-1分别干预VICs,通过检测细胞裂解液中钙离子浓度确定最佳浓度。用最佳干预浓度的GLP-1刺激细胞,提取RNA及蛋白,通过RT-PCR以及Western blot分别测定骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx-2)以及相关信号通路p65蛋白的表达情况。结果:GLP-1作用导致细胞裂解液钙离子浓度降低且最大刺激浓度为200 ng/mL。相比于对照组,GLP-1干预组OPN、Runx-2 mRNA和蛋白表达都降低,p65蛋白表达也降低。结论:GLP-1能够通过抑制p65的表达进而抑制VICs的钙化及其成骨表型分化。

AGE-LDL对人主动脉瓣间质细胞钙化和炎症反应的诱导作用及其机制

目的观察糖基化终产物修饰的低密度脂蛋白(AGE-LDL)对人主动脉瓣膜间质细胞(HAVICs)钙化和炎症反应的诱导作用,并探讨其机制。方法非CAVD瓣膜组织(non-CAVD组)取自手术治疗的主动脉瓣脱垂患者,CAVD瓣膜组织(CAVD组)取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行主动脉瓣膜置换术的患者。采用免疫组化法检测non-CAVD组和CAVD组中的AGE。取non-CAVD组的主动脉瓣膜组织,分离HAVICs,分为对照组、LDL组、AGE-HSA组和AGE-LDL组。对照组给予M199培养液,LDL组给予100μg/mL的LDL,AGE-HSA组给予100μg/mL的AGE-HSA,AGE-LDL组分别给予50、100、200μg/mL的AGE-LDL。取对照组和AGE-LDL组细胞培养21 d后进行茜红素染色,镜下观察细胞钙化情况。给药48 h后检测各组细胞中的细胞间黏附分子1(ICAM-1)、IL-6蛋白及细胞上清液中的IL-6、IL-8。用100μg/mL的AGE-LDL分别刺激HAVICs 0.5、1、2、4、8 h,以只加DMSO的细胞作为对照,检测HAVICs中NF-κB磷酸化水平。将HAVICs随机分为5个组,对照组给予M199培养液;LDL组给予100μg/mL的LDL;DMSO组给予含有1‰DMSO的M199培养液;AGE-LDL组给予100μg/mL的AGE-LDL;Bay11-7082组予2.5μmol/L的Bay11-7082干预30 min,然后给予100μg/mL的AGE-LDL;给药48 h后检测各组细胞中的ICAM、IL-6蛋白。结果与对照组相比,AGE-LDL组(100μg/mL亚组)细胞中钙盐沉积明显,形成钙结节。AGE-LDL组细胞中ICAM-1、IL-6蛋白相对表达量及培养液上清中IL-6、IL-8水平均高于对照组、LDL组、AGE-HSA组,且AGE-LDL组的50μg/mL亚组、100μg/mL亚组、200μg/mL亚组ICAM-1、IL-6蛋白相对表达量及IL-6、IL-8水平也依次增高(P均<0.05)。AGE-LDL可呈时间依赖性方式刺激HAVICs中的NF-κB/p65磷酸化,于作用2 h后达到峰值,4 h后开始减弱。AGE-LDL组、Bay11-7082组细胞中ICAM、IL-6蛋白相对表达量高于对照组、LDL组、DMSO组,且Bay11-7082组ICAM、IL-6蛋白相对表达量低于AGE-LDL组(P均<0.05)。结论 AGE-LDL可诱导HAVICs发生钙化及炎症反应,其机制可能与NF-κB信号通路活化有关。

骨髓间充质干细胞移植对兔腹主动脉成形术后血管内膜的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对兔腹主动脉再狭窄和平滑肌细胞增殖的影响及机制。方法将60只新西兰大白兔随机分为对照组、损伤组、移植组,各20只。损伤组和移植组送入球囊扩张损伤腹主动脉,移植组以1×107/kg细胞数将荧光标记的BMSC注射到损伤血管局部。术后4周免疫组织化学染色腹主动脉平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA),计算PCNA增殖指数,血管形态计量分析。结果损伤组新生血管内膜层α-SM-actin表达明显强于对照组(P<0.05);与损伤组比较,移植组新生血管内膜α-SM-actin表达明显增强(P<0.05)。损伤组PCNA阳性细胞数较对照组明显增多(P<0.05);移植组PCNA阳性细胞数较损伤组明显减少(P<0.05)。损伤组腹主动脉内膜厚度和面积、中膜厚度和面积、血管狭窄程度等明显高于移植组和对照组(P<0.05);移植组上述指标与对照组比较,无统计学差异(P>0.05)。结论 BMSC血管局部移植可抑制兔腹主动脉血管平滑肌细胞的增殖,减轻动脉粥样硬化及狭窄程度。