人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。

人乳头状瘤病毒16型E6蛋白在食管癌中的表达及与Cyclin D1的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16型E6蛋白在食管癌中的表达及与细胞周期蛋白Cyclin D1的关系。方法采用免疫组织化学法检测50例食管鳞癌组织、30例食管癌旁组织及30例正常食管黏膜组织中HPV 16型E6蛋白的表达情况,采用Western blot方法检测Cyclin D1在HPV 16型E6蛋白阳性及阴性的食管鳞癌组织中的表达水平。结果食管鳞癌组织中HPV 16型E6蛋白的阳性表达率高于正常食管黏膜组织(P<0.05),与食管癌旁组织差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤最大径较大者、肿瘤浸润较深者、淋巴结转移者HPV 16型E6蛋白的阳性表达率均较高(P<0.05)。HPV 16型E6蛋白阳性的食管鳞癌组织中Cyclin D1蛋白表达量高于阴性者(P<0.05)。结论 HPV 16型E6蛋白可能促进了食管癌的生长和恶化,并与Cyclin D1有一定的相关性,可作为食管癌的预后评估因子,为临床治疗提供一定的参考依据。

宫颈癌前病变中人乳头状瘤病毒16/18DNA整合状态的研究

目的探讨宫颈癌及癌前病变中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18DNA整合入宿主基因组的发生情况。方法选取128例HPV16/18阳性患者的液基细胞学剩余标本,其中炎症18例,CINⅠ35例,CINⅡ29例,CINⅢ24例,SCC22例。采用荧光定量PCR检测HPV16/18的E2和E6基因,根据E2/E6比值判定HPV16/18DNA的存在状态。结果①确定0.8和0.83分别为荧光定量PCR区分游离型和混合型HPV16/18的界值。②HPV16/18整合发生率与不同程度的宫颈病变有关,并且随着宫颈病变级别的升高,整合发生率呈上升趋势。③混合型在CINⅡ和CINⅢ中所占比例最高。结论HPV16/18整合是宫颈癌变的早期事件,与宫颈癌前病变的进展有关;荧光定量PCR可以作为细胞学筛查的一种有效方法,以发现向宫颈高度鳞状上皮病变、宫颈癌发展的高危患者。

E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒16/18型阳性患者分流的可行性

目的探讨E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒61(HPV)16/18型阳性患者分流的可行性。方法选取HPV 16/18型阳性的200例患者作为研究对象。所有患者均进行E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查及阴道镜活检检查。以病理结果为金标准,评估E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查对HPV 16/18型感染者的高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)及以上病变的诊断效能。结果在200例HPV 16/18型感染者中,阴道镜活检HSIL及以上病变的检出率仅为29.5%(59/200)。共107例患者HPV E6/E7 mRNA阳性,56例患者液基细胞学阳性。HPV E6/E7 mRNA阳性者HSIL及以上病变检出率高于阴性者(P<0.05);随着宫颈病变病理级别的提高,HPV E6/E7 mRNA阳性率呈升高趋势(均P<0.05),但液基细胞学异常率差异无统计学意义(P>0.05)。HPV E6/E7 mRNA诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为86.44%、60.28%,液基细胞学的灵敏度、特异度分别为25.42%、70.92%,HPV E6/E7 mRNA的灵敏度高于液基细胞学(P<0.05)。结论E6/E7 mRNA检测对HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病变具有较好的诊断效能,或可用于患者的进一步分流,以降低阴道镜的转诊率。

子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型感染与子宫颈癌及癌前病变的关系

目的研究子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型(HPV16·18型)感染与子宫颈癌及癌前病变的关系。方法我院妇产科宫颈疾病筛查中心对2003年1月～2005年6月求诊的20至60岁的已婚妇女6025例进行宫颈疾病诊疗,应用Taqman荧光PCR法定性检测宫颈分泌物HPV16·18型DNA,然后对HPV16·18型DNA阳性的妇女行阴道镜检查及宫颈组织活检病理检查。结果3550例HPV16·18型DNA阳性,其中慢性宫颈炎2628例(74.1%),子宫颈癌前病变(CINⅠ～Ⅱ级)874例(24.6%),子宫颈癌(包括原位癌)48例(1.4%)。慢性宫颈炎HPV16·18型DNA含量为115±20,子宫颈癌前病变HPV16·18型DNA含量为323±15,子宫颈癌的HPV16·18型DNA含量为625±57。结论Taqman荧光PCR方法可作为检测子宫颈HPV16·18型感染的手段,且可作为宫颈癌前筛查除病理学之外较可靠的检查方法。

人乳头状瘤病毒16和18型感染与乳腺增生症和乳腺癌的关系

目的:探讨人乳头状瘤病毒(human papil-lomavirus HPV)16、18型感染与乳腺增生症、乳腺癌的关系。方法:采用原位杂交法检测HPV16、HPV18在正常乳腺组织、乳腺增生组织和乳腺癌中的表达。结果:HPV16在乳腺癌、乳腺增生症及正常乳腺组织各60例中的感染率分别为51·67%(31/60)、31·67%(19/60)和11·67%(7/60),差异有统计学意义,P<0·05;HPV18感染率分别为56·67%(34/60)、35·00%(21/60)和15·00%(9/60),差异有统计学意义,P<0·05;HPV16和18在乳腺癌、乳腺增生症及正常乳腺组织中的共感染率分别为48·33%(29/60)、15·00%(9/60)和6·67%(4/60),其中乳腺增生症与正常乳腺组织共感染率差异无统计学意义,而与乳腺癌差异有统计学意义,P<0·01。结论:本组乳腺癌和乳腺增生症组织中HPV16和HPV18感染率明显高于正常乳腺组织中的感染率;HPV16和HPV18感染与乳腺增生、乳腺癌的关系有待进一步探讨。

人乳头状瘤病毒16型与口腔鳞癌关系的Meta分析

目的 :探讨人乳头状瘤病毒 16型与口腔鳞癌的关系。方法 :采用Meta分析法对收集到的国内有关口腔鳞癌与人乳头状瘤病毒 16型关系的研究进行综合的定性和定量研究。结果 :口腔鳞癌与人乳头状瘤病毒 16型存在相关关系 ,口腔鳞癌与人乳头状瘤病毒 16型关系的合并优势比 (ORc 值 )为 6 81。结论

雌激素对人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响

目的:探讨雌激素对人乳头状瘤病毒16(HPV 16)型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响。方法:以不同浓度的17-β-雌二醇(E_2)处理人永生化表皮细胞系(Ha Cat)后,绘制其生长曲线,以细胞活性测定法(MTT)测定细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brd U)测定细胞周期时相。脂质体转染法将含HPV 16 E6基因的质粒转染入经不同药物处理后的细胞中,以Real-time PCR法测定细胞中该基因的表达。结果:浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2促进细胞数目的增加(P<0.05);浓度为10^(-8)~10^(-6) mol/L的E_2明显增强细胞活性(P<0.05);浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2使Ha Cat细胞的细胞周期时相缩短(P<0.05);不同浓度E_2处理组细胞周期的分布差异无统计学意义(P>0.05)。当Ha Cat细胞被HPV 16E6质粒转染,随着E_2浓度的增加,HPV 16 E6 m RNA表达明显增加(P<0.05)。结论:E_2可加速Ha Cat细胞生长与增殖,增加HPV 16 E6转染Ha Cat细胞的效率,E_2水平升高可能增加HPV感染的风险。

人乳头状瘤病毒16型伪病毒载体对肝癌细胞系HepG2细胞的杀伤研究

目的构建基于人乳头状瘤病毒(HPV)16型的伪病毒载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2细胞的杀伤活性。方法利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白,在体外将病毒蛋白包装白喉毒(DT)A链表达型质粒,形成伪病毒。透射电镜观察病毒样颗粒(VLP)的结构,并转染肝癌细胞系HepG2,乳酸脱氢酶释放法检测对肝癌细胞系HepG2的杀伤能力。结果透射电镜观察显示病毒蛋白可自我组装成VLP,在转染肝癌细胞系HepG2后,乳酸脱氢酶释放法成功检测到伪病毒对肝癌细胞系HepG2的杀伤作用。结论基于HPV16的新型伪病毒载体能成功转染肝癌细胞系HepG2,并产生杀伤活性,为肝癌的基因治疗提供了一种可选择的方法。

基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响

目的探讨新疆妇女宫颈病变中Toll样受体9(TLR9)和泛素蛋白连接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表达与人乳头状瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法以人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测86例慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织HPV感染及分型;Illumina Hiseq测序平台对15例宫颈病变组织进行转录组测序;通过免疫组化SP法检测TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CINⅡ-Ⅲ和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平。结果宫颈癌的HPV感染率为100%(41/41),CINⅡ-Ⅲ的感染率为60%(15/25),慢性宫颈炎的感染率为15%(3/20),其中HPV16为主要感染型别;转录组测序结果显示,HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2);免疫组化结果显示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宫颈癌组织中高表达,其表达水平呈正相关(r分别为0.510和0.469,P值均<0.001)。结论在宫颈癌发展过程中,HPV16感染可能通过泛素-蛋白酶体降解途径影响TLR9蛋白表达,具体调控机制需要深入研究。

人乳头状瘤病毒16/18型在口腔疣状癌中的表达及意义

目的 研究人乳头状瘤病毒 16 /18型在口腔疣状癌中的表达状况 ,探讨其在口腔疣状癌发生发展中的生物学意义。方法 采用SP免疫组化和原位杂交方法分别检测 8例正常口腔粘膜、13例疣状癌、10例高分化鳞状细胞癌、10例低分化鳞癌组织中HPV16 /18E6蛋白和HPV16 /18DNA的表达。结果 ①疣状癌HPV16 /18E6蛋白及HPV16 /18DNA阳性表达率均为 6 9.2 % (9/13) ,E6蛋白平均染色强度高于高分化鳞状细胞癌和低分化鳞状细胞癌组 (P <0 .0 5 )。②免疫组化方法检测HPV16 /18E6蛋白与原位杂交方法检测HPV16 /18DNA结果有良好的一致性。结论 HPV16 /18型感染是口腔疣状癌的重要致病因子 ,与高分化鳞状细胞癌、低分化鳞状细胞癌组织相比 ,HPV16 /18型感染与疣状癌的关系更为密切。

老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的相关性

目的分析老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒(HPV)16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的关系。方法 40例宫颈癌患者均按计划进行根治性放射治疗前后采用实时定量反转录聚合酶链反应(PT-PCR)检测宫颈癌组织中HPV16-E6、p53 mRNA的表达水平,并根据治疗结果分为有效组29例和无效组11例,分析HPV16-E6、p53与放疗敏感性的关系。结果治疗总有效率为72.50%;放疗前后无效组2例HPV16-E6、p53 mRNA和蛋白差异无统计学意义(P>0.05),放疗前后有效组4例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表达水平明显改善,HPV16-E6蛋白表达水平显著低于无效组,p53蛋白表达水平显著高于无效组(P<0.05)。结论 HPV16-E6感染、p53基因异常参与了老年宫颈癌发生、发展过程,检测HPV16-E6、p53 mRNA的表达可判断宫颈癌组织放疗敏感性。

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒(HPV)16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系,确证HPV与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法,将pSV HPV16 DNA导入原代培养的人喉上皮细胞,继续培养、传代,取20代细胞,用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段,用免疫组化染色检测E6、E7 蛋白的表达,用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代,细胞含有HPV16 DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达,细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长,生长曲线呈典型的"S"型,细胞增殖指数为48%,所有细胞均表达角蛋白,胞浆含张力原纤维,软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16 DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系,为喉癌研究提供了新的理想模型,HPV16对人喉上皮有致癌作用,在喉癌组织标本中检测到的HPV16 DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。

新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型L1基因突变谱分析

目的 探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒 16型L1基因的变异 ,并预测L1蛋白的功能变化。方法 从 19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以此DNA为模板 ,PCR扩增HPV16L1全长基因 ,PCR产物直接测序或克隆后测序 ,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16L1基因多态性及HPV16L1蛋白功能的变化。结果PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16L1阳性率为 84 2 1% (16 / 19) ;测序和序列分析表明L1基因核苷酸多处发生变异 ,并引起编码氨基酸的变异 ,L1基因在核苷酸水平形成上 6种突变模式(XJL1 1～XJL1 6 ) ,各模式与HPV16原型比较 ,同源性在 99 6 9%～ 99 87%之间。XJL1 1发生的 4处变异是所有变异序列所共有的 ,XJL1 2～XJL1 6在XJL1 1变异的基础上增加了不同的变异 ;在氨基酸水平上形成 4种突变模式 ,其中XJL1 1/ 2 / 3突变模式占 76 92 % (8/ 13) ,是突变的主流模式 ;以上突变引起HPV16L1蛋白疏水性和抗原性的改变 ,继而改变了L1蛋白的结构及功能。结论 中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16L1基因发生多位点变异 ,并形成多种突变模式和突变的主流模式 ;这些突变引起HPV16L1蛋白疏水性和抗原性的改变 。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型上游调控区DNA多态性分析

目的探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV-16)上游调控区(upstream regulatory region,URR)的变异及其与新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生的关系。方法从19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA,以此DNA为模板,PCR扩增HPV-16 URR DNA片段,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV-16 URR DNA多态性。结果PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV-16 URR阳性率为89．47％(17/19)；测序和序列分析表明,与HPV-16原型比较,HPV-16 URR核苷酸多处发生变异,URR在核苷酸水平上形成11种突变模式(XJU-1～XJU-11),XJU-1和XJU-4突变模式各占23．53％(4/17),其余各突变模式均占5．88％(1/17),各模式与HPV-16 URR原型比较,同源性在98．50％～99．68％之间。在各位点的突变中,7192位(G→T)、7520位(G→A)的突变(100％,17/17)在新疆地区趋于恒定,该两处突变在亚裔美洲型(AA)中普遍存在,与病毒感染及宫颈癌发生相关；7729位(A→C)、7843位(A→G)、7792位(C→T)的突变可显著提高启动子的转录活性；其余突变尚未见报道,部分突变为新疆地区分离的HPV-16 URR所特有。结论中国新疆南部HPV-16 URR基因发生变异,HPV-16 URR的突变与HPV-16的系统发生以及新疆维吾尔族妇女高发宫颈癌存在一定关系。

人乳头状瘤病毒16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型和巨细胞病毒感染与宫颈癌发生、发展的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)和巨细胞病毒(CMV)感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法对43例宫颈癌、47例宫颈上皮瘤样病变(CIN)、56例宫颈炎和10例正常宫颈进行聚合酶链反应检测HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染情况。结果HSVⅡ、HPV16/18和CMV的阳性率在宫颈癌和CIN组、CINⅢ级和CINⅠ～Ⅱ级组均有递减趋势,且差异有统计学意义。Ⅱ期宫颈癌组HPV16/18阳性显著高于Ⅰ期宫颈癌组,高分化宫颈癌组HPV16/18和HSVⅡ阳性高于中分化组,与临床分期及组织类型差异均无统计学意义;CMV阳性与临床分期、组织分级及组织类型差异均无统计学意义。三种病毒感染拷贝数,HSVⅡ和HPV16/18:宫颈癌>CIN>宫颈炎;CMV:宫颈癌>CIN。宫颈癌中出现几种病毒混合感染,其中HPV16/18合并HSVⅡ明显多于HPV16/18合并CMV者。结论HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染与宫颈癌的发生发展关系密切,且与病毒负荷量有关,可能是宫颈癌的致病因子。

98例宫颈癌人乳头状瘤病毒16型E6基因突变及多态性分析

目的研究湖北地区宫颈癌患者人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E6基因点突变分布及频率，与国内外其他研究人员发现的踊突变进行对比，分析历突变在宫颈癌发生中的意义。方法从宫颈癌患者手术切除标本中提取组织DNA，用HPV16E6特异性引物进行PCR扩增，对扩增的历基因片段进行测序分析。结果在35例宫颈癌组织DNA中有18例发生历基因178位核苷酸的突变，变突频率为51．43％，相应核苷酸改变为Asp—Glu，442位核苷酸有4例发生核苷酸序列的改变，突变频率为11．43％，另有10例发生1～2个核苷酸序列的改变。结论湖北地区98例宫颈癌患者人乳头状瘤病毒历基因存在高频率的178和442位核苷酸突变，一些为新发现的核苷酸序列的突变，这些突变在宫颈癌发生中的作用有待于进一步研究。

宫颈癌患者人乳头状瘤病毒16型感染与P53基因表达及临床意义

目的探讨宫颈癌中人乳头状瘤病毒（HPV）16型感染和P53基因表达情况，并探讨两者之间的交互作用。方法收集119例宫颈鳞癌患者为病例组，124例经检查证实无宫颈癌病变的患者为对照组；采用PCR及免疫组化法检测HPV16DNA及P53基因的表达情况。结果HPV16型感染阳性率病例组88．7％，对照组5．2％，两组比较差异有统计学意义（X2=173．4，P〈0．05），P53基因表达阳性率病例组67．4％、对照组11．3％，两组比较差异有统计学意义（X2=80．1，P〈0．05）；多元回归模型结果显示，HPV16型感染及P53基因表达呈现阳性均显著增加宫颈癌的发病风险，OR为74．1及16．2、95％CI：30．8～181．5及7．9～34．1（P〈0．05）；由Spearman相关分析可知，HPV16型感染和P53基因表达相关（P〈0．05）。结论HPV、P53是宫颈癌独立的致癌物，两者在宫颈癌的发展过程中有交互作用。

实时荧光定量PCR测定人乳头状瘤病毒16型E7基因方法学的建立及其在宫颈疾病诊断中的应用价值

宫颈癌是世界妇女第2高发肿瘤，每年新发病例493000人，并导致274000人死亡。高危型人乳头状瘤病毒（HPV），尤其是HPV16型，在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用。病毒早期，E7基因是导致宫颈上皮细胞恶性转化和永生化的重要因素，其编码的E7蛋白通过与pRb结合，干扰细胞周期调控及DNA修复，从而使细胞不稳定性增加。

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。