人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定

目的:制备人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)18型阳性的肿瘤疫苗,并观察其体外活性。方法:利用昆虫杆状病毒(简称Bac to Bac)表达系统,将HPV18L1基因重组入穿梭质粒pFastBac-Htb,构建HPV18L1-Htb,通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组,分离重组的Bacmid DNA,并转染Sf-9昆虫细胞进行表达;透射电镜观察病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的形成;用Ni-NTA系统纯化表达蛋白;以小鼠红细胞凝集试验鉴定蛋白生物活性。结果:收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测在相对分子质量大约63000处可出现一新生蛋白条带,Western blotting证实为HPV18L1蛋白;透射电镜观察证实L1蛋白可自我组装成VLP,且主要定位于细胞核;小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白在0.5～4ng/μl范围可介导小鼠红细胞凝集。结论:Bac to Bac表达系统可高效地制备HPVVLP,并具有体外生物学活性;Ni-NTA系统能高效简便地纯化带有6×His短肽的HPV18L1蛋白。

宫颈鳞状上皮病变中人乳头状瘤病毒18型检测结果分析

目的探讨HPV18与不同级别宫颈上皮内瘤变、不同临床病理特征宫颈癌的关系。方法采用原住杂交法检测HPV18在60例宫颈癌和60例宫颈上皮内瘤变及10例正常宫颈组织中的表达情况。结果正常宫颈组织中未见HPV18表达，宫颈上皮内瘤变组（8％）和宫颈癌组（15％）发现有HPV18表达；HPV18与宫颈鳞癌肌层浸润深度及淋巴结转移密切相关（P〈0．05），与临床分期、组织学分级无明显关系（P〉0．05）。结论HPV18表达与否可能是预测宫颈癌患者转归的影响因素之一，可以将其作为判断宫颈癌生物学行为和预后的参考指标。

人乳头状瘤病毒18型E6蛋白的信号转导初探

目的探讨人乳头状瘤病毒18型E6蛋白（HPV18E6）与信号转导和转录激活因子1（STAT1）、蛋白激酶R（PKR）／真核细胞翻译启始因子2α（eIF2α）、核因子-κBp65（NF—κBp65）、丝裂酶原激活的蛋白激酶（MAPK）／c—Jun氨基末端激酶（JNκ）信号转导的关系以及可能的分子机制。方法构建靶向HPV18E6癌基因及无关序列（NC序列）的短发夹结构RNA（shRNA）干扰序列的慢病毒载体（HPV18E6-RNAi-LV，NC-GFP—LV），转染宫颈癌HeLa细胞，在沉默HPV18E6癌基因表达的基础上，以RT-PCR、Westernblot法分别在核酸、蛋白水平（包括磷酸化型）检测各组HPV18E6、STAT1、PKR、eIF2α、NF—κBp65、MAPK、JNK的表达，以transwell侵袭试验及MTr法检测各组HeLa细胞侵袭能力及对卡铂敏感性的差异。结果HPV18E6癌基因的表达水平能影响NF-κBp65、PκR基因的核酸及蛋白表达水平，并影响磷酸化蛋白p-STAT1、P—PκR、P-eIF2α的磷酸化水平；HPV18E6-RNAi-LV转染组细胞侵袭抑制率及对卡铂的敏感程度明显高于其他组（P〈0．05或P〈0．01）。结论HPV18E6通过降低PκR表达，并使p-STAT1、p-PκR、P-eIF2α去磷酸化的方式抑制PκR／eIF2α信号传导通路激活，维持HeLa细胞增殖活性及侵袭能力，也可抑制凋亡。HPV18E6与MAPK／JNK信号转导关系尚不明确。

E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒16/18型阳性患者分流的可行性

目的探讨E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒61(HPV)16/18型阳性患者分流的可行性。方法选取HPV 16/18型阳性的200例患者作为研究对象。所有患者均进行E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查及阴道镜活检检查。以病理结果为金标准,评估E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查对HPV 16/18型感染者的高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)及以上病变的诊断效能。结果在200例HPV 16/18型感染者中,阴道镜活检HSIL及以上病变的检出率仅为29.5%(59/200)。共107例患者HPV E6/E7 mRNA阳性,56例患者液基细胞学阳性。HPV E6/E7 mRNA阳性者HSIL及以上病变检出率高于阴性者(P<0.05);随着宫颈病变病理级别的提高,HPV E6/E7 mRNA阳性率呈升高趋势(均P<0.05),但液基细胞学异常率差异无统计学意义(P>0.05)。HPV E6/E7 mRNA诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为86.44%、60.28%,液基细胞学的灵敏度、特异度分别为25.42%、70.92%,HPV E6/E7 mRNA的灵敏度高于液基细胞学(P<0.05)。结论E6/E7 mRNA检测对HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病变具有较好的诊断效能,或可用于患者的进一步分流,以降低阴道镜的转诊率。

人乳头状瘤病毒16和18型感染与乳腺增生症和乳腺癌的关系

目的:探讨人乳头状瘤病毒(human papil-lomavirus HPV)16、18型感染与乳腺增生症、乳腺癌的关系。方法:采用原位杂交法检测HPV16、HPV18在正常乳腺组织、乳腺增生组织和乳腺癌中的表达。结果:HPV16在乳腺癌、乳腺增生症及正常乳腺组织各60例中的感染率分别为51·67%(31/60)、31·67%(19/60)和11·67%(7/60),差异有统计学意义,P<0·05;HPV18感染率分别为56·67%(34/60)、35·00%(21/60)和15·00%(9/60),差异有统计学意义,P<0·05;HPV16和18在乳腺癌、乳腺增生症及正常乳腺组织中的共感染率分别为48·33%(29/60)、15·00%(9/60)和6·67%(4/60),其中乳腺增生症与正常乳腺组织共感染率差异无统计学意义,而与乳腺癌差异有统计学意义,P<0·01。结论:本组乳腺癌和乳腺增生症组织中HPV16和HPV18感染率明显高于正常乳腺组织中的感染率;HPV16和HPV18感染与乳腺增生、乳腺癌的关系有待进一步探讨。

宫颈癌前病变中人乳头状瘤病毒16/18DNA整合状态的研究

目的探讨宫颈癌及癌前病变中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18DNA整合入宿主基因组的发生情况。方法选取128例HPV16/18阳性患者的液基细胞学剩余标本,其中炎症18例,CINⅠ35例,CINⅡ29例,CINⅢ24例,SCC22例。采用荧光定量PCR检测HPV16/18的E2和E6基因,根据E2/E6比值判定HPV16/18DNA的存在状态。结果①确定0.8和0.83分别为荧光定量PCR区分游离型和混合型HPV16/18的界值。②HPV16/18整合发生率与不同程度的宫颈病变有关,并且随着宫颈病变级别的升高,整合发生率呈上升趋势。③混合型在CINⅡ和CINⅢ中所占比例最高。结论HPV16/18整合是宫颈癌变的早期事件,与宫颈癌前病变的进展有关;荧光定量PCR可以作为细胞学筛查的一种有效方法,以发现向宫颈高度鳞状上皮病变、宫颈癌发展的高危患者。

人乳头状瘤病毒16/18型在口腔疣状癌中的表达及意义

目的 研究人乳头状瘤病毒 16 /18型在口腔疣状癌中的表达状况 ,探讨其在口腔疣状癌发生发展中的生物学意义。方法 采用SP免疫组化和原位杂交方法分别检测 8例正常口腔粘膜、13例疣状癌、10例高分化鳞状细胞癌、10例低分化鳞癌组织中HPV16 /18E6蛋白和HPV16 /18DNA的表达。结果 ①疣状癌HPV16 /18E6蛋白及HPV16 /18DNA阳性表达率均为 6 9.2 % (9/13) ,E6蛋白平均染色强度高于高分化鳞状细胞癌和低分化鳞状细胞癌组 (P <0 .0 5 )。②免疫组化方法检测HPV16 /18E6蛋白与原位杂交方法检测HPV16 /18DNA结果有良好的一致性。结论 HPV16 /18型感染是口腔疣状癌的重要致病因子 ,与高分化鳞状细胞癌、低分化鳞状细胞癌组织相比 ,HPV16 /18型感染与疣状癌的关系更为密切。

子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型感染与子宫颈癌及癌前病变的关系

目的研究子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型(HPV16·18型)感染与子宫颈癌及癌前病变的关系。方法我院妇产科宫颈疾病筛查中心对2003年1月～2005年6月求诊的20至60岁的已婚妇女6025例进行宫颈疾病诊疗,应用Taqman荧光PCR法定性检测宫颈分泌物HPV16·18型DNA,然后对HPV16·18型DNA阳性的妇女行阴道镜检查及宫颈组织活检病理检查。结果3550例HPV16·18型DNA阳性,其中慢性宫颈炎2628例(74.1%),子宫颈癌前病变(CINⅠ～Ⅱ级)874例(24.6%),子宫颈癌(包括原位癌)48例(1.4%)。慢性宫颈炎HPV16·18型DNA含量为115±20,子宫颈癌前病变HPV16·18型DNA含量为323±15,子宫颈癌的HPV16·18型DNA含量为625±57。结论Taqman荧光PCR方法可作为检测子宫颈HPV16·18型感染的手段,且可作为宫颈癌前筛查除病理学之外较可靠的检查方法。

宫颈癌发病与人乳头状瘤病毒l6/18型感染的相关性

将宫颈癌患者治疗前的活检组织,包括子宫颈鳞癌(n=38),腺癌(n=43),使用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的HPVDNAPCR检测试剂盒及美国PE公司PCR扩增仪检测人乳头瘤病毒(HPV)l6/18型。81例宫颈癌中64例HPV为阳性,检出率为79.0%;子宫颈鳞癌HPV16型阳性20例(52.6%),HPV18型阳性8例(21.1%);子宫颈腺癌HPV16型阳性8例(18.6),HPV18型阳性28例(65.1%)。宫颈癌与HPV感染高度相关(P<0.05)。感染了HPVl8型较多向腺癌转化,感染了HPV16型较多向鳞癌转化。

环介导等温扩增法检测人乳头瘤病毒16、18的应用研究

目的:环介导等温扩增技术检测人乳头瘤病毒HPV16、18的应用研究。方法:收集宫颈癌行HC-Ⅱ-HPV检测标本高危型的47例,低危型34例。阴性对照20例,分别利用环介导等温扩增(LAMP)方法和PCR方法进行检测,并对检测结果进行比对分析。结果:HC-Ⅱ-HPV筛查的高危组标本中,LAMP检出HPV16和HPV18的阳性率分别是37%和6%,均高于PCR的31%和4%,在HC-Ⅱ-HPV筛查的低危组标本中,LAMP法和PCR法均有高危型别的检出。LAMP法略优于PCR法,二者比较无统计学差异(P>0.05)。结论:LAMP法在HPV高危型16、18的筛查中与PCR法无差异,然而LAMP法是更经济、便捷的HPV16、18亚型筛查方法。

膀胱黏膜增生性病变与人乳头瘤病毒(HPV)16/18型感染的相关性研究

目的探讨膀胱黏膜增生性病变的病原机制,研究与人乳头瘤病毒16/18感染的相关性。方法随机选取慢型性膀胱炎32例、膀胱黏膜增生性病变43例的组织标本,采用聚合酶链反应(PCR)法检测组织中HPV16/18的感染阳性率,进行统计学分析。结果HPV16/18型感染率慢性膀胱炎组为71.88%,膀胱黏膜增生性病变组81.40%(其中腺性膀胱炎78.57%,瘤样增生100%,上皮鳞化80%,腺性膀胱炎伴上皮鳞化85.71%),两组间感染率差异无统计学意义。结论膀胱黏膜上皮的HPV16/18感染可能是膀胱黏膜增生性病变的重要致病因素。膀胱黏膜HPV16/18感染可能在慢性膀胱炎→增生型膀胱炎→膀胱癌的发生和发展过程中起着重要作用。

乳腺浸润性导管癌组织中HPV16/18型感染和Rb蛋白的表达状态及相关性研究

目的探讨乳腺良恶性病变中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18型感染和Rb蛋白的表达状态及其相关性。方法收集2016年1月—2017年12月广西壮族自治区柳州市人民医院乳腺外科乳腺手术切除标本为研究对象,其中浸润性导管癌(IDC)68例为IDC组、乳腺不典型导管上皮增生(ADH)30例为ADH组、乳腺纤维腺瘤旁正常乳腺组织30例为正常乳腺组。原位杂交法检测HPV16/18 DNA,免疫组织化学检测Rb蛋白的表达情况。结果IDC组中HPV16/18 DNA阳性率高于正常乳腺组和ADH组;Rb蛋白阳性表达率低于正常乳腺组和ADH组(均P<0.05)。三组HPV16/18 DNA感染与Rb蛋白表达均呈负相关性(r=-0.802、-0.774、-0.802,均P<0.05)。IDC患者HPV16/18DNA、Rb蛋白的表达与组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期密切相关(P<0.01)。结论HPV16/18型感染和Rb蛋白的表达缺失可能涉及人乳腺癌的发生、发展过程。

人乳头状瘤病毒16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型和巨细胞病毒感染与宫颈癌发生、发展的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)和巨细胞病毒(CMV)感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法对43例宫颈癌、47例宫颈上皮瘤样病变(CIN)、56例宫颈炎和10例正常宫颈进行聚合酶链反应检测HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染情况。结果HSVⅡ、HPV16/18和CMV的阳性率在宫颈癌和CIN组、CINⅢ级和CINⅠ～Ⅱ级组均有递减趋势,且差异有统计学意义。Ⅱ期宫颈癌组HPV16/18阳性显著高于Ⅰ期宫颈癌组,高分化宫颈癌组HPV16/18和HSVⅡ阳性高于中分化组,与临床分期及组织类型差异均无统计学意义;CMV阳性与临床分期、组织分级及组织类型差异均无统计学意义。三种病毒感染拷贝数,HSVⅡ和HPV16/18:宫颈癌>CIN>宫颈炎;CMV:宫颈癌>CIN。宫颈癌中出现几种病毒混合感染,其中HPV16/18合并HSVⅡ明显多于HPV16/18合并CMV者。结论HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染与宫颈癌的发生发展关系密切,且与病毒负荷量有关,可能是宫颈癌的致病因子。

瑞琳他抗/HIFU治疗后未转阴预警因素:基于110例HPV16/18感染的回归性研究

目的:探讨人乳头瘤状病毒(HPV)16/18感染患者瑞琳他抗/高强度聚焦超声(HIFU)治疗后未转阴的预警因素及其对临床治疗决策的指导价值。方法:选取2020年5月至2021年12月我院110例HPV16/18感染的低级别鳞状上皮内病变(LSIL)及以下患者进行回顾性研究,根据瑞琳他抗/HIFU治疗后HPV16/18感染转阴情况分为转阴组、非转阴组,对非转阴情况进行单因素及多因素Logistic回归分析。结果:年龄41~50岁患者非转阴的风险是<25岁的12.762倍,HPV16/18双重感染患者非转阴的风险是HPV 16(+)或18(+)患者的22.231倍,HPV-mRNA E6/E7(+)患者非转阴的风险是(-)患者的37.722倍,伴阴道炎患者非转阴风险是无阴道炎患者的9.463倍,采用HIFU治疗患者非转阴的风险是药物治疗患者的0.430倍,性伴数量≥2个患者非转阴的风险是性伴=1个患者的12.731倍,尿液1-羟基芘浓度亦与转阴情况相关(P<0.05)。多因素Logistic回归方程:Logit(P)=-11.054+2.546×年龄41~50岁+3.101×HPV16/18双重感染+3.630×HPV-mRNA E6/E7(+)+2.247×阴道炎-0.843×HIFU治疗+2.544×性伴数量≥2个+2.702×尿液1-羟基芘浓度;该模型预测瑞琳他抗/HIFU治疗后转阴的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.901(95%CI 0.830~0.949),敏感度为86.11%,特异度为82.93%。结论:年龄、HPV16/18双重感染、HPV-mRNA E6/E7(+)、阴道炎、性伴数量、尿液1-羟基芘浓度均是HPV16/18感染患者瑞琳他抗/HIFU治疗后未转阴的预警因素,通过对以上预警因素的评价可为临床选取非手术治疗或外科手术治疗决策提供参考,既避免持续感染贻误病情,又可避免过度治疗增加患者负担。

HPV18 E7致癌蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的为进一步研究人乳头状瘤病毒18(Human papillomavirus 18,HPV18)E7蛋白的结构与功能。方法构建HPV18 E7的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质粒pGEX-6P-1-GST-HPV18E7,重组质粒转入大肠埃希菌BL21进行可溶性融合蛋白的高效表达。结果柱上切除法去除GST标签,表达产物经glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化,获得了SDS-PAGE和HPLC-ESI-MS纯度的HPV18 E7均质蛋白,非变性PAGE和凝胶过滤表明HPV18 E7以稳定的单体形式存在于水溶液中。高压液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析得到HPV18 E7精确分子量为12865.0 Da,与其理论值吻合。纯化蛋白经HPLC-ESI-MS/MS鉴定为目的产物,鉴定出的9个匹配肽段覆盖率为HPV18 E7整个氨基酸序列的96.5%。结论本文所建立的技术可以有效地大量制备HPV18 E7,为进一步研究其结构与功能和致癌机制奠定了重要的物质基础。

人乳头状瘤病毒16/18及单纯疱疹病毒2型协同感染与宫颈病变的相关性分析

目的观察宫颈病变妇女人乳头状瘤病毒16／18（HPV16／18）、单纯疱疹病毒2型（HSVⅡ）的感染情况，分析和探讨HPV16／18及HSVⅡ协同感染与宫颈病变的相关性。方法选择2013年1～12月于海西州人民医院妇科就诊的217例患者，其中正常宫颈20例、宫颈炎55例、宫颈上皮内瘤变（CIN）117例、宫颈癌25例，采用实时荧光定量PCR法分别检测HPV16／18和HSVⅡ，比较HPV16／18和HSVⅡ的感染情况，并分析HPV16／18及HSVⅡ协同感染与宫颈病变的相关性。结果宫颈癌组HPV16／18和HSVⅡ感染阳性检出率显著高于正常宫颈组、宫颈炎组及CIN组，而CIN组HPV16／18和HSVⅡ感染阳性检出率显著高于正常宫颈组及宫颈炎组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；各宫颈病变患者主要为HPV16／18感染，且病情越严重，HPV16／18及HSVⅡ感染阳性检出率越高。与单一的HPV16／18、HSVⅡ感染相比，除宫颈炎患者外，CIN和宫颈癌患者均出现HPV16／18和HSVⅡ混合感染，但混合感染的发生率显著低于单一的HPVl6／18、HSVⅡ感染，差异有统计学意义（尸〈0．05）。结论HPVl6／18、HSVⅡ协同感染可增加宫颈癌的患病率，与宫颈癌的发生及发展有密切的关系，对高风险人群进行筛查可提高宫颈癌的早期诊断率及治疗率。

HPV-16,-18型致宫颈癌机制及其疫苗研究

宫颈癌病例中,人乳头瘤病毒16(HPV-16),-18型的检出率可高达50%～70%。HPV-16,-18型诱发宫颈癌的主要机制是其E6和E7基因在宫颈细胞中表达增加,其基因产物E6和E7两个癌蛋白分别与抑癌蛋白P53和pRb结合,进而诱导P53和PRb蛋白降解。HPV疫苗包括预防性和治疗性疫苗。国际上预防性疫苗只有GSK的Cervarix疫苗和Merke公司的Gardsil疫苗,主要预防HPV-16,-18型感染以及HPV-16,-18型相关性宫颈肿瘤和生殖器疣的发生。预防性疫苗是通过细胞免疫和体液免疫以去除或减少已经被感染的细胞或肿瘤细胞,其靶蛋白主要为E6或E7。到目前为止治疗性疫苗的类型虽然很多,主要包括肽类疫苗、病毒载体疫苗及DNA疫苗等。因为治疗性疫苗的机制比较复杂,目前还在实验阶段。

高危16和18型人乳头瘤病毒感染与口咽癌的相关性

目的检测口咽癌患者的HPV-16和HPV-18感染情况,了解不同HPV型别在口咽癌中的分布特点及相关性分析。方法本研究设置实验组和对照组,实验组为71例口咽癌标本,对照组为83例非口咽癌标本。在本院病理科切取蜡块标本,脱蜡,用加碱煮沸法提取DNA后进行PCR扩增,最后进行导流斑点杂交法杂交,实验结果采用SPSS22.0分析软件统计。结果 71例口腔癌标本中有16例检出HPV,其中检出8例HPV-16(占所有型别的50%),5例HPV-18(占所有型别的31.25%),2例HPV-11和1例HPV-33;83例正常标本内均未检出HPV感染。实验组中HPV-16和HPV-18的感染率差异无统计学意义(P=0.390)。结论口咽癌患者中HPV-16和HPV-18的检出率之间没有显著性差异,这与有关文献报道不同,可能为地域差异引起的。