人乳头瘤病毒DNA、E6/E7 mRNA及液基薄层细胞学检查对女性宫颈癌的筛查价值

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)DNA、E6/E7 mRNA及液基薄层细胞学检查(TCT)对女性宫颈癌的筛查价值。方法选取28021例体检女性,均接受HPV DNA、E6/E7 mRNA和TCT单项或多项检测,记录HPV DNA、E6/E7 mRNA、TCT单独及联合检测对宫颈癌的检出情况。以组织活检结果为金标准,评估HPV DNA、E6/E7 mRNA、TCT单独或联合检测对宫颈癌的筛查价值。结果TCT、HPV DNA、E6/E7 mRNA对宫颈癌的检出率分别为8.8%、26.9%、29.7%。各方法单独检测时,TCT单独检测筛查宫颈癌的特异度最高(85.53%),但灵敏度最低(28.44%),HPV DNA单独检测筛查宫颈癌的灵敏度最高(60.25%)。两种方法联合检测时,HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测筛查宫颈癌的灵敏度最高(81.75%),特异度最低(26.34%),TCT+HPV DNA联合检测筛查宫颈癌的特异度(61.08%)和阴性预测值(57.11%)最高,任意两种方法联合检测筛查宫颈癌的灵敏度、特异度比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。TCT+HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测筛查宫颈癌的灵敏度、特异度与HPV DNA+E6/E7 mRNA检测比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05),但灵敏度高于TCT+E6/E7 mRNA联合检测,特异度低于TCT+E6/E7 mRNA联合检测,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论HPV DNA检测适合作为女性健康体检者宫颈癌筛查的首选方法,E6/E7 mRNA与TCT检测可作为宫颈癌进一步检查的优选。HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测具有较高的灵敏度和阳性预测值,可作为年轻女性宫颈癌筛查的优选方案,联合检测对提高阳性率及降低假阳性率有帮助。

腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的 为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法 在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果 在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论 携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 。

吉林省宫颈病变患者人乳头瘤病毒16型E6、E7基因变异分析

目的通过调查吉林省人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E6、E7基因变异,评估HPV16基因变异与吉林省地区宫颈癌前病变及宫颈癌发生的相关风险。方法收集129例HPV16感染的宫颈癌及癌前病变患者的宫颈脱落细胞,提取细胞DNA,以特异性引物用聚合酶链反应法(PCR)扩增E6-E7基因序列,再将E6-E7基因序列与标准的HPV16型基因序列比对,寻找E6-E7基因的突变位点。结果共发现8个E6突变位点,其中错义突变6个,无义突变位点2个,突变发生率较高的突变位点为:T178G(59/129,45.74%),A131C(10/129,7.75%),T350G(6/129,4.65%),T178A(6/129,4.65%)。共发现11个E7基因突变位点,其中错义突变位点6个,无义突变位点5个,突变率较高的位点为A647G(57/129,44.19%),T846C(55/129,42.64%),G666A(34/129,26.36%),T843C(20/129,15.50%)。E6、E7常见的突变位点在宫颈癌组和癌前病变组分布均差异无统计学意义。本研究中仅发现了亚洲变异型和欧洲变异型。经统计学分析发现,吉林省HPV16原型、As、Eur在宫颈癌和癌前病变中的分布差异有统计学意义(P=0.02),其中以亚洲变异型为主。结论本研究中吉林省仅发现HPV16的As、Eur2种变异型,且以As变异型为主;在吉林省HPV16 E6、E7常见的变异位点与宫颈病变的进展无关。

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。

人乳头状瘤病毒持续感染状态下E6、E7蛋白mRNA在宫颈癌不同分期的表达结果

目的探讨人乳头状瘤病毒（HPV）持续感染状态下E6、E7蛋白mRNA在宫颈癌不同分期的表达。方法选择2012年8月至2015年8月该院收治的宫颈癌患者91例。TNM分期为Ⅰ期32例,Ⅱ期29例,Ⅲ期30例。另选同期该院体检的42例宫颈慢性炎性患者进行对照。所有患者宫颈组织标本实施超薄液基细胞学检查（TCT）,并做HPV E6/E7mRNA及HPV DNA检测,比较各种方法的检测结果,分析HPV E6/E7mRNA与宫颈癌分期的相关性及与HPV DNA检测的一致性。结果慢性炎性HPV DNA阳性检出率较HPV E6/E7mRNA更高,而宫颈癌Ⅰ~Ⅲ期的HPV E6/E7mRNA阳性检出率更高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。随着宫颈病变程度增加,HPV E6/E7mRNA及HPV DNA的相对拷贝值均逐渐增大,不同宫颈癌分期的患者HPV E6/E7mRNA及HPV DNA的相对拷贝值差异均有统计学意义（P〈0.05）。HPV E6/E7mRNA阳性检出率及相对拷贝值与宫颈癌分期均呈正相关,且与HPVDNA检测具有较好的一致性。结论HPV持续感染状态下E6、E7蛋白mRNA的表达与宫颈癌不同分期有关,HPV E6/E7mRNA检测有助于早期判断宫颈癌病情进展,具有临床价值。

人乳头状瘤病毒E6、E7蛋白在维吾尔族及汉族宫颈癌发展中的表达及意义

目的 分析维吾尔族及汉族宫颈癌患者中人乳头状瘤病毒（HPV）E6、E7蛋白表达与宫颈癌癌前病变恶性进展的关系,进一步了解其在维吾尔族及汉族宫颈癌患者间是否存在差异。方法 选取2013年4月~2014年4月在新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊行第二代杂交捕技术HPV DNA检测结果为阳性的133例维吾尔族（n=75）和汉族（n=58）患者宫颈不同病变程度的石蜡包埋宫颈组织。采用免疫组化法分别检测各组织中HPV E6、E7蛋白表达,使用Spearman等级相关分析HPV E6、E7蛋白表达与病变程度的相关性,并采用χ2检测比较维吾尔族及汉族宫颈癌患者HPV E6、E7蛋白表达的差异。结果 维吾尔族和汉族慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3、宫颈鳞癌组织中HPV E6的阳性率,随着病情的进展呈逐渐增高趋势,差异均有统计学意义（χ2=39.61,P=0.001;χ2=19.77,P=0.001）;Spearman等级相关分析发现,维吾尔族及汉族宫颈癌患者HPV E6蛋白的表达与宫颈病变级别均呈显著正相关（r=0.708,P=0.001;r=0.729,P=0.001）、HPV E7在维吾尔族和汉族慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率,随着病情的进展呈逐渐增高,多组比较差异有统计学意义（χ2=32.48,P=0.001;χ2=24.16,P=0.001）;Spearman等级相关分析发现,维吾尔族及汉族宫颈癌患者E6蛋白表达与宫颈病变级别均呈显著正相关（r=0.649,P=0.001;r=0.759,P=0.001）;慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3维吾尔族患者HPV E6、E7蛋白的阳性表达率高于汉族,维吾尔族宫颈癌患者HPV E6、E7蛋白表达率低于汉族,但差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 HPV E6、E7蛋白是维吾尔族和汉族宫颈癌发展的重要因素,HPV E6、E7蛋白可能具有预测宫颈病变进展的价值。

高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈CIN2+病变筛查中的应用价值

目的探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)E6/E7mRNA在子宫颈上皮内瘤变中度及以上(CIN2+级)病变筛查中的临床应用价值。方法选取2016年6月至2017年6月在北京市垂杨柳医院因接触性阴道出血或疑似宫颈病变妇科门诊就诊的患者307例,均行液基薄层细胞检查(TCT)、HPVDNA、HPVE6/E7mRNA的检测,并行阴道镜检查及活检。以病理结果为金标准,将病检结果为高级别鳞状上皮内病变(HSIL,包括CIN2和CIN3)或宫颈鳞癌或宫颈腺癌的71例患者作为观察组,记为CIN2+;将病检结果正常和低级别鳞状上皮内病变(LSIL,包括CIN1)的236例患者作为对照组,记为CIN2-。分析TCT、HPVDNA、HPVE6/E7mRNA的灵敏度和特异度差异。结果HPVE6/E7mRNA及HPVDNA对CIN2+诊断的特异度分别为79.66%及19.49%,差异有统计学意义(P<0.05)。HPVE6/E7mRNA联合TCT及HPVDNA联合TCT检测对CIN2+诊断的特异度分别为82.63%及35.17%,差异有统计学意义(P<0.05)。HPVE6/E7mRNA、HPVDNA在筛查CIN2+的ROC曲线下面积分别为0.8420和0.5693,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HPVE6/E7mRNA较HPVDNA检测筛查宫颈CIN2+的病变效果更好,HPVE6/E7mRNA联合TCT检测能够提高对CIN2+的病变筛查的特异性。

E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒16/18型阳性患者分流的可行性

目的探讨E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒61(HPV)16/18型阳性患者分流的可行性。方法选取HPV 16/18型阳性的200例患者作为研究对象。所有患者均进行E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查及阴道镜活检检查。以病理结果为金标准,评估E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查对HPV 16/18型感染者的高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)及以上病变的诊断效能。结果在200例HPV 16/18型感染者中,阴道镜活检HSIL及以上病变的检出率仅为29.5%(59/200)。共107例患者HPV E6/E7 mRNA阳性,56例患者液基细胞学阳性。HPV E6/E7 mRNA阳性者HSIL及以上病变检出率高于阴性者(P<0.05);随着宫颈病变病理级别的提高,HPV E6/E7 mRNA阳性率呈升高趋势(均P<0.05),但液基细胞学异常率差异无统计学意义(P>0.05)。HPV E6/E7 mRNA诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为86.44%、60.28%,液基细胞学的灵敏度、特异度分别为25.42%、70.92%,HPV E6/E7 mRNA的灵敏度高于液基细胞学(P<0.05)。结论E6/E7 mRNA检测对HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病变具有较好的诊断效能,或可用于患者的进一步分流,以降低阴道镜的转诊率。

宫颈组织人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA ATG-12 Tie-1表达情况及与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的 分析宫颈组织人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白12(ATG12)、酪氨酸激酶受体1(Tie-1)表达情况,及与子宫颈鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法 将2017年1月至2020年12月在南阳市中心医院保存宫颈活检组织或手术切除宫颈组织的228例患者按2014年WHO女性下生殖道肿瘤分类标准分组,分别纳入慢性宫颈炎组(n=34)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组(n=20)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组(n=55)、宫颈鳞癌(CSCC)组(n=119)。通过分支DNA杂交实验(bDNA)法检测宫颈组织HPVE6/E7 mRNA表达情况,利用免疫组化法检测宫颈组织ATG12、Tie-1表达情况,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析HPV E6/E7mRNA、ATG-12、Tie-1表达情况对HSIL+(HSIL、CSCC)的筛查价值。结果 HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于慢性宫颈炎组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于慢性宫颈炎组,差异均有统计学意义(P<0.05);LSIL组与慢性宫颈炎组,差异无统计学意义(P<0.05);HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于LSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于LSIL组(P<0.05),CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于HSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于HSIL组(P<0.05);ROC曲线显示,单一HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1筛查HSIL+时,Tie-1阴性的曲线下面积(AUC)最大,筛查灵敏度为78.16%,特异度为83.33%,3者联合筛查HSIL+的AUC值上升至0.856,灵敏度、特异度分别为89.66%、81.48%,高于HPV-E6/E7 mRNA阳性、ATG-12阴性、Tie-1阴性筛查的AUC值(P<0.05)。结论 不同SIL病理分级的宫颈组织HPVE6/E7mRNA、ATG12、Tie-1阳性表达率存在差异,较单纯HPVE6/E7mRNA筛查HSIL+,联合ATG12或Tie-1检测可提升筛查特异度。

口腔鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16型转化基因E_7的检测

【目的】准确检测口腔鳞状细胞癌及正常口腔粘膜中人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)的感染状况 ,探讨人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌之间的关系。【方法】从 30例未经治疗的口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织及 30例健康志愿者正常口腔粘膜切取标本 ,液氮冷冻保存 ;常规提取组织DNA ,设计HPV16E7转化基因特异性引物 ,进行聚合酶链反应 ,对PCR结果进行检测 ,记录结果。【结果】 30例口腔鳞状细胞癌患者中检测到 11例HPV16阳性 ,感染率 36 7% ;30例正常对照组中检测到 4例HPV16阳性 ,感染率 11 1%。经 χ2 检验 ,两者差别有显著性。【结论】人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌有一定关系 ,但HPV16在人口腔鳞状细胞癌发生发展过程中所起的作用还有待进一步研究。

人乳头状瘤病毒86E7重组蛋白的高效表达、纯化和表征

[目的]基因工程法构建谷胱甘肽S-转移酶(GST)-人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus)HPV86 E7融合蛋白表达质粒,高效表达、纯化、鉴定蛋白质和分析蛋白质的存在形式。[方法]GST-HPV86 E7融合蛋白基因与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7,重组质粒转入BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-HPV86 E7,柱上切除GST标签,Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE、MALDI-TOF和色谱质谱联用系统分别用于蛋白质纯度分析、分子量测定和蛋白鉴定;非变性电泳和分子筛排阻色谱用于蛋白质四级结构的分析。[结果]HPV86 E7大肠杆菌中正确表达,基质辅助激光解析飞行时间质谱测得的HPV86 E7精确分子量为(11319.76±5.66)Da。反相高压液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定的匹配肽段有11个肽段,氨基酸的覆盖率为90%。非变性PAGE和凝胶过滤层析实验观察到了HPV86 E7的单聚体、二聚体及多聚体。[结论]重组质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7成功构建,诱导后高效表达GST-HPV86 E7融合蛋白,HPV86 E7得到纯化,质谱分析证实表达蛋白为86E7蛋白,以多聚体形式存在。

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查、分流中的价值分析

目的比较人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA与HPV-DNA分别及联合液基薄层细胞学检查(thin-prep cytology test,TCT)在宫颈病变筛查中的价值及HPV E6/E7 mRNA与HPV-DNA在非典型鳞状细胞(ASC-US)分流中的价值。方法纳入2022年1月~2023年12月于扬州大学医学院附属盐城妇幼保健院进行宫颈癌筛查的2079名受检者,行TCT、HPV-DNA、HPV E6/E7 mRNA检测,剔除3项结果均阴性者,513例行阴道镜活检。以病理报告为金标准,比较HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA的宫颈病变检出率。对HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA单独筛查及分别联合TCT筛查CIN2+(包括CIN2、CIN3及宫颈癌)的效能进行比较。对HPV-DNA与HPV E6/E7 mRNA分流ASC-US的效能进行比较。结果HPV-DNA CIN1检出率4.08%高于HPV E6/E7 mRNA的2.45%,差异有统计学意义(χ^(2)=8.787,P=0.003),而两种筛查方法CIN2+检出率差异无统计学意义(χ^(2)=0.250,P=0.617)。HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA筛查CIN2+的灵敏度为85.98%vs.81.09%、特异度为49.57%vs.84.24%,HPV-DNA的筛查灵敏度高于E6/E7 mRNA、特异度低于E6/E7 mRNA,两种筛查方法的特异度、阳性预测值及假阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=94.732、32.802、94.732,P=0.000)。TCT联合HPV-DNA和TCT联合HPV E6/E7 mRNA筛查CIN2+的灵敏度为94.51%vs.90.85%、特异度为85.37%vs.90.26%,联合TCT提高了筛查的灵敏度和特异度,但TCT联合HPV-DNA的筛查特异度仍低于TCT联合HPV E6/E7 mRNA,两种联合筛查方法的特异度和假阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=3.871、3.871,P=0.049)。HPV E6/E7 mRNA在ASC-US中筛查CIN2+的ROC曲线下面积为0.814,大于HPV-DNA的0.704,差异有统计学意义(χ^(2)=2.352,P<0.05)。结论与HPV-DNA相比,HPV E6/E7 mRNA单独筛查及分别与TCT联合筛查CIN2+均有更高的特异度,对ASC-US的分流管理更具优势。

人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查中的价值

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7mRNA检测在宫颈癌早期筛查中的价值。方法对700例疑似患者进行HPV E6/E7mRNA及导流杂交基因芯片分型检测,对其阳性检出率、敏感性、特异性进行分析评价。结果 HPV导流杂交基因芯片分型阳性检出率80.0%,HPV E6/E7mRNA阳性检出率37.3%(P<0.05);在3个宫颈细胞病理学分级中,HPV导流杂交基因芯片分型与HPV E6/E7mRNA检测的阳性率随级别增加而增高,但基因芯片分型检测更为明显(P<0.05);随访分析中HPV E6/E7mRNA检测的特异性、阳性预测值均明显优于HPV导流杂交基因芯片分型。结论在宫颈癌筛查中,HPV导流杂交基因芯片分型结合HPV E6/E7mRNA检测对疾病进一步明确诊断具有较大意义。

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达(英文)

目的分析不同部位、分期的结直肠腺癌及正常黏膜组织中人乳头状瘤病毒(human pap illomavirus,HPV)16型E7的表达状况。方法应用PCR及免疫组化方法检测82例手术切除的结直肠癌新鲜标本及距肿瘤近端10cm以远的正常黏膜组织中HPV 16 E7 DNA及蛋白的表达。结果结直肠癌组织HPV 16 E7 DNA表达阳性率为51.22%(42/82),明显高于正常黏膜组织的4.88%(4/82),P<0.05;直肠癌组织中HPV16 E7 DNA表达阳性率为64.10%(25/39),明显高于升结肠癌的18.18%(2/11),P<0.05;HPV 16 E7 DNA表达阳性率与Dukes分期有关(P<0.05),与癌组织分化程度无关。免疫组化染色显示,HPV 16 E7蛋白主要为细胞核表达,胞浆亦可见少量表达,进一步确认了HPV 16的感染,且HPV 16 E7蛋白与HPV 16 E7基因的表达具有相关性,免疫组化敏感性较PCR方法为低。结论结直肠癌组织HPV 16 E7 DNA及蛋白的表达阳性率明显高于正常黏膜组织,提示部分结直肠癌存在HPV 16感染。癌灶部位距肛门越近,感染率越高;Dukes分期越晚感染率越高。

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在不典型鳞状细胞患者中的临床应用

目的 探讨人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA检测在无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASC-US）患者中的临床应用价值.方法 对320例ASC-US患者进行HPV E6/E7mRNA和高危型HPV（HR-HPV）DNA检测,结合病理学诊断资料进行统计学分析.结果 CINⅡ＋级和CINⅢ＋级的HPV E6/E7mRNA阳性率分别高于CINⅡ-级和CINⅢ-级,差异均有统计学意义（P〈0.001）;不同等级宫颈病变的HPV E6/E7mRNA拷贝数不同,差异有统计学意义（P〈0.001）,且宫颈病变级别与mRNA拷贝数之间呈正相关.HPV E6/E7mRNA与HR-HPV DNA检测CINⅡ＋级和CINⅢ＋级的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值差异均无统计学意义（P〉0.05）;两者特异度比较,差异有统计学意义（P〈0.001）.结论 HPV E6/E7mRNA检测作为ASC-US的分流指标更确切有效,是目前ASC-US患者是否阴道镜转诊的较佳分流策略.

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的检测在宫颈癌筛查中的初步评价

目的:评价支链DNA技术(bDNA)对HPV-E6/E7 mRNA的检测及其临床价值。方法:对167例宫颈癌筛查妇女宫颈脱落细胞用液基细胞薄层涂片技术行宫颈细胞学检查,同时采用bDNA技术检测HPV-E6/E7 mRNA。另从中随机选择43例患者[11例非典型磷状上皮细胞(ASCUS)、17例低度磷状上皮内病变(LSIL)、15例高度磷状上皮内病变(HSIL)]检测HPV-E6/E7DNA。结果:①HPV-E6/E7 mRNA与HPV-E6/E7 DNA相关性分析显示:HPV-E6/E7 mRNA与HPV-E6/E7 DNA检测结果呈现显著正相关(r=0.465,P=0.002);②总体人群HPV-E6/E7 mRNA检出阳性率为43.1%,随着病理级别的升高,HPV-E6/E7mRNA阳性率(χ2=41.396,P<0.001)和copies量(H=39.350,P<0.001)均呈现趋势性升高;③HPV-E6/E7 mRNA对LSIL+诊断的灵敏度为67.1%(95%CI:56.1%-78.1%)、特异性为74.2%(95%CI:65.5%-82.9%)、准确性为71.3%(95%CI:64.4%-78.1%)、阳性预测值为65.3%(95%CI:54.3%-76.3%)、阴性预测值为75.8%(95%CI:67.2%-84.4%)。结论:HPV-E6/E7 mRNA与宫颈细胞学类型相关,其对LSIL+的诊断具有较高的效率,可能更为适用于宫颈癌的发病风险评估。

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析

目的分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别，选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因，将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体，进行双向测序、分析。结果构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒，命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。ＤＮＡ序列分析表明，该序列全长７７６ｂｐ，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第５５７位核苷酸“Ｔ”变为“Ｃ”，即Ｅ６的终止密码子ＴＡＡ变为谷氨酰胺密码子ＣＡＡ。结论中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的基因结构与德国标准株ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因之间存在差异。

液基薄层细胞学检查联合人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的价值分析

目的探讨薄层液基细胞学检查(thinprep cytology test,TCT)联合人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) E6/E7mRNA检测在宫颈疾病筛查中的应用效果。方法选取538例患者作为研究对象,所有患者均行TCT、HPV E6/E7检测和阴道镜下宫颈多点活检,比较单独使用TCT或HPV E6/E7 mRNA以及联合TCT和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的诊断价值。结果以病理学检查作为检测金标准,TCT和HPV E6/E7这两种检测方法对于宫颈病变均具有一定的筛检率,TCT检测的灵敏度66.56%,特异度为53.57%,HPV E6/E7 mRNA检测的灵敏度74.84%,特异度为77.68%,TCT联合HPV E6/E7mRNA检测的灵敏度和特异度分别为99.68%和39.29%。结论 TCT联合HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中可大幅度提高灵敏度,降低临床漏诊率,具有临床筛查价值。

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。