尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒11型L1基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析HPV11的晚期表达基因序列L1及其编码的氨基酸序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法采用PCR技术扩增了1例尖锐湿疣患者疣组织中HPV 11 L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析。结果本例尖锐湿疣临床标本HPV 11 L1基因与GenBank收录的原型(收录号:M14119)比较有8个碱基变异。结论 中国地区尖锐湿疣HPV 11 L1基因存在着变异。

人乳头瘤病毒11型L1基因原核表达系统的构建及鉴定

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1原核表达系统pBAD(B)鄄HPV11L1,表达HPVL1蛋白,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础。方法PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型L1基因片段,克隆至pBluescript质粒,并测序。将其从克隆重组质粒中切下连入表达载体,建立pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达重组质粒,在大肠杆菌宿主菌Top10中,经阿拉伯糖诱导,表达融合蛋白L1,经SDS鄄PAGE电泳和Westernblot进行鉴定。结果3株HPV11L1经测序发现变异一致,每株均有2个核苷酸变异,但未影响氨基酸变化。经SDS鄄PAGE鉴定L1蛋白相对分子质量为59×103,与预期值相同,Westernblot证明表达蛋白能与单克隆抗体反应,成功构建了pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达系统。结论所构建的pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达系统能够高效表达HPV11L1蛋白。

人乳头瘤病毒11型DNA中CpG基序甲基化状态分析及生物活性的研究

目的 对人乳头瘤病毒 11型全核苷酸序列的CpG基序 (CpGmotifs)进行分析 ,为阐明尖锐湿疣的发病机制和提高DNA疫苗的效能奠定理论基础。方法 对从pBR32 2 HPV11重组质粒上酶切下来的HPV11全长DNA进行计算机分析 ,包括分类、计数和定位 ;并用限制性内切酶PCR法分析HPV11DNA中CpG基序的甲基化状态 ,即分别用甲基化敏感的限制性内切酶AccⅡ、HaeⅡ和HpaⅡ对HPV11DNA进行酶切消化 ,再以HpaⅡ切割位点侧翼序列为引物 ,以HpaⅡ酶切产物为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增HPV11DNA片断 ,并用HPV11DNA刺激表达有pCIneo TLR9的HEK2 93细胞 ,ELISA法检测TNF al pha、IFN alpha和IL 12的分泌。结果 CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤 ,“G”的侧翼为两个嘧啶 ,在HPV11中共 14个。HPV11全基因组被AccⅡ切成 2个片断、被HaeⅡ切成 3个片断、被HpaⅡ切成 5个片断 ,而且以HpaⅡ酶切产物为模板进行PCR扩增 ,未能得到相应的片断。HPV 11DNA刺激有人TLR9表达的HEK2 93细胞后能检测到TNF alpha、IFN alpha和IL 12的分泌。结论 乳头瘤病毒 11型DNA中含有GACGTT等非甲基化的CpG基序 。

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的 构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法 用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果 经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论 获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的 :构建人乳头瘤病毒 16型与 11型 L 1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法 :采用 PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒 11型晚期基因 L 1,并对其进行克隆测序 ;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒 16型和 11型 L 1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中 ,分别位于强启动子 Ppolh和弱启动子 P10之下 ;利用酶切和 PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果 :PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒 11型的 L1基因 ,得到人乳头瘤病毒 16型 L1和 11型 L1基因双价重组杆状病毒转移质粒 ,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论 :本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒 ,为进一步构建双价 L 1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果:克隆出HPV11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7。本研究克隆出的HPV11E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化。结论:本研究克隆出的HPV11E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。

宫颈人乳头病毒6与11型感染阴道镜检查的必要性探讨

目的探讨宫颈人乳头病毒(HPV)6、11型阳性,宫颈液基薄层细胞学(TCT)正常且无自觉症状女性进行阴道镜检查的必要性。方法选取2016年1月至2019年9月本院收治的172例HPV6、11型阳性,TCT检查正常且无自觉症状女性作为研究对象,均行妇科检查、阴道镜检查,记录并分析检查结果。结果妇科检查宫颈光滑116例,行阴道镜检查结果均为宫颈HPV6、11型潜伏感染;妇科检查宫颈单纯型糜烂样改变52例,行阴道镜检查、组织病理检查发现宫颈HPV6、11型宫颈潜伏感染9例(17.3%),亚临床感染24例(46.1%),临床感染(宫颈尖锐湿疣)19例(36.5%),妇科检查宫颈颗粒型糜烂样改变4例,行阴道镜检查、组织病理检查发现HPV6、11型临床感染(宫颈尖锐湿疣)4例(100.0%)。宫颈单纯型糜烂样改变病理结果异常明显高于宫颈光滑者,差异有统计学意义(P<0.05),宫颈单纯型糜烂样改变的宫颈HPV临床感染及亚临床感染率与宫颈颗粒型糜烂样改变比较差异无统计学意义。结论HPV6、11型阳性,TCT正常,无自觉症状妇女,妇科检查宫颈光滑者可不转诊阴道镜;妇科检查宫颈有赘生物或有糜烂样改变者应转诊阴道镜,以发现肉眼难以识别的宫颈HPV6、11型临床感染(宫颈尖锐湿疣)及宫颈HPV6、11型亚临床感染,及时治疗宫颈HPV6、11型临床感染(宫颈尖锐湿疣)及亚临床感染,指导潜伏感染者使用避孕套,以防止性疾病传播。

乳头瘤病毒11型完整基因组成功转染角质形成细胞并促其增殖

构建含人乳头瘤病毒11型(Human papillomavirus type11,HPV11)完整开放读码框(Open reading frame,ORF)基因组的质粒并对其功能进行初步验证,为构建HPV11转基因动物模型奠定基础。分别构建重组质粒pQE-Trisystem-EGFP/HPV11(pE/H)、pQE-Trisystem-EGFP/1.1copyHPV11(pE/1.1H),将pE/1.1H、pE/H、闭环状HPV11基因组分别转染原代人角质形成细胞(Keratinocyte,KC)并进行检测。在质粒上成功构建了目的序列,转染后在pE/1.1H组、pE/H组、HPV11组中检测到HPV11E6基因的表达;在pE/1.1H组、pE/H组中检测到荧光;HPV11组、pE/H组、pE/1.1H组具备促细胞增殖功能,实验组间比较pE/1.1H组稍弱(P<0.01),但与对照组相比均差异极显著(P<0.01)。将具有完整ORF的HPV11基因组(1.1copyHPV11)成功构建于质粒上,其具备野生型HPV11病理表型;为研究低危型HPV致病机理提供了实验材料和方法学指导;为进一步构建HPV11转基因小鼠奠定了基础。

外生殖器尖锐湿疣与人乳头瘤病毒6/11型关系的研究

目的应用FQ-PCR检测外生殖器患者人乳头瘤病毒(HPV)6/11型的感染率,探讨外生殖器尖锐湿疣与人乳头瘤病毒6/11型关系。方法采用FQ-PCR对150例外生殖器尖锐湿疣患者(患者组)及98例泌尿生殖道炎患者(对照组)乳头瘤病毒HPV6/11型及HPV16/18型同时进行检测。结果患者组HPV6/11的检出率为79.33%,其中HPV6型、HPV11型的检出率分别为67.33%、66.00%;HPV16/18的检出率为5.33%。HPV6/11与HPV16/18的检出率有明显差异(χ2=94.12,P<0.01);HPV6型与HPV11型检出病率无明显差异(χ22=0.06,P>0.05)。对照组98例全部为阴性。结论外生殖器尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒以HPV6型与HPV11为主。

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因,并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因,与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1/E7;重组质粒转入BL21大肠杆菌,经诱导表达融合蛋白GST-E7;该蛋白经剪刀酶切除GST,GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pGEX-6P-1/E7成功构建,诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化,蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11E7蛋白,为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。

尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒6和11型的感染率及其L1基因的表达

目的了解尖锐湿疣组织标本中人乳头瘤病毒6型（HPV-6）和11型（HPV-11）感染率的差异,构建HPV-6型主要衣壳蛋白L1基因原核表达系统,建立ELISA方法检测标本中L1基因表达情况.方法采用基于HPV-6型和HPV-11型11基因的双重PCR,检测尖锐湿疣组织标本中HPV-6型和HPV-11型的感染率;采用PCR扩增HPV-6型全长L1基因,T-A克隆后测序,构建原核表达系统pET32a-L1-E.coli BL21（DE3）,采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rL1的表达.制备rL1兔抗血清,用免疫双扩散试验检测抗血清的效价;建立ELISA方法检测标本中L1基因的表达情况.结果116例患者尖锐湿疣组织标本中,92.2%（107/116）检出HPV-6型和/或HPV-11型.其中单一HPV-6型阳性者占70.1%（75/107）,单一HPV-11型阳性者占23.4%（25/107）,HPV-6型和HPV-11型混合感染者占6.5%（7/107）.与报道的相应序列比较,所克隆的HPV-6型L1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.20%～99.93%和99.80%～100%.IPTG能诱导rL1表达,rL1兔抗血清免疫双扩散效价为1：4.尖锐湿疣组织标本88.8%（103/116）检出L1蛋白.结论成功地构建了HPV-6型L1基因原核表达系统,并建立了HPV-6型和HPV-11型L1基因分型的双重PCR和L1蛋白ELISA检测方法.浙江省尖锐湿疣患者主要感染HPV-6型,病灶中HPV高频率表达病毒主要衣壳蛋白L1.

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。

表没食子儿茶素没食子酸酯对HPV11早期基因E6、E7mRNA表达的影响

目的利用人工构建的含人乳头瘤病毒（HPV）11型基因组的HaCaT细胞（简称为HPVll．HaCaT细胞），研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对该细胞生长的抑制作用，以及受试物对HPVll早期基因E6和E7mRNA表达的影响。方法在HaCaT及HPVll．HaCaT细胞培养基中添加不同浓度的EGCG后，应用MTT比色法检测受试物对细胞生长增殖的影响；用相对荧光定量PCR法检测HPVll．HaCaT细胞中HPVllE6、E7mRNA表达的改变。结果EGCG能抑制HaCaT和HPVll．HaCaT细胞的生长，不同浓度EGCG作用下，细胞生存率为52％-95％、64％～90％，呈浓度和时间依赖趋势。EGCG作用于细胞12h和24h后，HPVll．HaCaT细胞中HPVllE6、E7基因的mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。结论EGCG在体外能抑制含HPVll基因组的HaCaT细胞生长，并能抑制HPVll功能基因E6、E7表达。

人乳头状瘤病毒11型E7抗原HLA-A＊0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定

目的筛选和鉴定人乳头状瘤病毒11型E7抗原（HPV11E7）HLA-A＊0201限制性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位。方法预测HPV11E7抗原HLA-A＊0201限制性CTL表位并合成相对应的表位多肽和四聚体（tetramer），即HPV11E7 7-15（TLKDIVLDL）、15-23（LQPPDPVGL）、47-55（PLTQHYQIL）、81-89（DLLLGTLNI）和82-90（LLLGTLNIV）。从健康HLA-A＊0201成人外周血单一核细胞诱导树突状细胞（DC）并负载上述表位多肽，流式细胞技术检测DC成熟分化标记及ELISA法检测DC分泌的IL-12；成熟DC负载各组多肽后观察DC激活T淋巴细胞的效应，ELISA法检测T细胞分泌的IFN-γ；四聚体检测抗原特异性CD8^＋T细胞及乳酸脱氢酶（LDH）释放法评价DC诱导的CTL对靶细胞的特异性体外杀伤效应。结果预测的5条HPV11ET表位多肽均能诱导DC的成熟分化；E77-15、82-90和15-23多肽负载的DC能激活T淋巴细胞分泌高水平IFN-γ；E77-15多肽负载的DC能刺激特异性tetramer^＋CD8^＋细胞增殖且其诱导的CTL对HPV11E7／293细胞产生高效率的特异性杀伤作用（P〈0．05）。结论筛选并鉴定出1条HPV11E7HL-A＊0201限制性CTL表位E77-15（TLKDIVLDL），负载该表位肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应，抗原性较强，有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位。

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的 构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法 运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果 所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论 所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 。

抗HPV11/E2基因Ribozyme对靶RNA的体外剪切研究

为了寻找HPV11型引起的生殖系统感染的治疗途径和探讨HPV的致病机理 ,本实验以HPV11病毒质粒为模板 ,扩增出HPVll型E2区 6 44bp片段 ,采用pGEM T EasyVector为载体 ,构建 pTV 6 44克隆载体 ,经筛选得到克隆株 ,提取质粒测序鉴定。采用上海生化所陈农安教授编制的锤头状Ribozyme设计软件进行计算机分析 ,选择Ribozyme对靶基因的最佳剪切位点 ,及进行基因同源性分析和生物学功能分析 ,选择出针对HPVllE2靶基因的RZ2 777,在最适条件下进行体外剪切反应 ,发现人工合成和体外转录得到的Ribozyme分子均能在相应位点准确切割靶RNA分子 ,选择合适的反应条件切割效率达到 6 0 %以上 ,Km和Kcat值分别为 0 .6 3μmol/L、0 .12 μmol/L ,RibozymeL两端的 5′ cis ribozyme和 3′ cis ribozyme自我剪切释放并未影响切割活性 ,但靶RNA侧翼序列影响了Ribozyme的剪切活性。实验研究表明 ,Ribozyme可能成为治疗HPVll型引起的尖锐湿疣的有效手段 ,并有望在分子水平上开辟出基因治疗HPVll病毒感染的另一新天地。

大肠杆菌来源的人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

【目的】利用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒(HPV11VLPs),并对其免疫原性和所诱导中和抗体的型交叉反应性进行研究。【方法】在大肠杆菌ER2566中非融合表达HPV11-L1蛋白,并通过离子交换层析,疏水相互作用层析其进行纯化。纯化后的HPV11-L1经体外组装形成病毒样颗粒,通过动态光散射,透射电镜检测其形态,并通过多种HPV型别假病毒中和实验评价HPV11VLPs的免疫原性及型交叉反应性。【结果】HPV11-L1蛋白在大肠杆菌中可以以可溶形式表达。经过硫酸铵沉淀、离子交换和疏水相互作用色谱纯化,目的蛋白纯度能够达到95%以上。纯化的HPV11-L1蛋白去除还原剂DTT后,能够在体外自发组装成为直径约50nm、与天然病毒颗粒形态高度相似的VLPs。动物实验结果显示,该病毒样颗粒在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量(ED50)为0.031μg,在小鼠体内可诱导高达106的中和抗体滴度,这些中和抗体与HPV6有较好的交叉反应,与HPV18有一定的交叉反应,而与HPV16没有明显的交叉反应,这一结果与分子进化树的分析相一致。【结论】本研究利用原核表达系统获得了具有较高免疫原性的HPV11VLPs,为HPV11预防性疫苗的研制奠定了良好的基础。