吉林省宫颈病变患者人乳头瘤病毒16型E6、E7基因变异分析

目的通过调查吉林省人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E6、E7基因变异,评估HPV16基因变异与吉林省地区宫颈癌前病变及宫颈癌发生的相关风险。方法收集129例HPV16感染的宫颈癌及癌前病变患者的宫颈脱落细胞,提取细胞DNA,以特异性引物用聚合酶链反应法(PCR)扩增E6-E7基因序列,再将E6-E7基因序列与标准的HPV16型基因序列比对,寻找E6-E7基因的突变位点。结果共发现8个E6突变位点,其中错义突变6个,无义突变位点2个,突变发生率较高的突变位点为:T178G(59/129,45.74%),A131C(10/129,7.75%),T350G(6/129,4.65%),T178A(6/129,4.65%)。共发现11个E7基因突变位点,其中错义突变位点6个,无义突变位点5个,突变率较高的位点为A647G(57/129,44.19%),T846C(55/129,42.64%),G666A(34/129,26.36%),T843C(20/129,15.50%)。E6、E7常见的突变位点在宫颈癌组和癌前病变组分布均差异无统计学意义。本研究中仅发现了亚洲变异型和欧洲变异型。经统计学分析发现,吉林省HPV16原型、As、Eur在宫颈癌和癌前病变中的分布差异有统计学意义(P=0.02),其中以亚洲变异型为主。结论本研究中吉林省仅发现HPV16的As、Eur2种变异型,且以As变异型为主;在吉林省HPV16 E6、E7常见的变异位点与宫颈病变的进展无关。

人乳头瘤病毒DNA、E6/E7 mRNA及液基薄层细胞学检查对女性宫颈癌的筛查价值

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)DNA、E6/E7 mRNA及液基薄层细胞学检查(TCT)对女性宫颈癌的筛查价值。方法选取28021例体检女性,均接受HPV DNA、E6/E7 mRNA和TCT单项或多项检测,记录HPV DNA、E6/E7 mRNA、TCT单独及联合检测对宫颈癌的检出情况。以组织活检结果为金标准,评估HPV DNA、E6/E7 mRNA、TCT单独或联合检测对宫颈癌的筛查价值。结果TCT、HPV DNA、E6/E7 mRNA对宫颈癌的检出率分别为8.8%、26.9%、29.7%。各方法单独检测时,TCT单独检测筛查宫颈癌的特异度最高(85.53%),但灵敏度最低(28.44%),HPV DNA单独检测筛查宫颈癌的灵敏度最高(60.25%)。两种方法联合检测时,HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测筛查宫颈癌的灵敏度最高(81.75%),特异度最低(26.34%),TCT+HPV DNA联合检测筛查宫颈癌的特异度(61.08%)和阴性预测值(57.11%)最高,任意两种方法联合检测筛查宫颈癌的灵敏度、特异度比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。TCT+HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测筛查宫颈癌的灵敏度、特异度与HPV DNA+E6/E7 mRNA检测比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05),但灵敏度高于TCT+E6/E7 mRNA联合检测,特异度低于TCT+E6/E7 mRNA联合检测,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论HPV DNA检测适合作为女性健康体检者宫颈癌筛查的首选方法,E6/E7 mRNA与TCT检测可作为宫颈癌进一步检查的优选。HPV DNA+E6/E7 mRNA联合检测具有较高的灵敏度和阳性预测值,可作为年轻女性宫颈癌筛查的优选方案,联合检测对提高阳性率及降低假阳性率有帮助。

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查、分流中的价值分析

目的比较人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA与HPV-DNA分别及联合液基薄层细胞学检查(thin-prep cytology test,TCT)在宫颈病变筛查中的价值及HPV E6/E7 mRNA与HPV-DNA在非典型鳞状细胞(ASC-US)分流中的价值。方法纳入2022年1月~2023年12月于扬州大学医学院附属盐城妇幼保健院进行宫颈癌筛查的2079名受检者,行TCT、HPV-DNA、HPV E6/E7 mRNA检测,剔除3项结果均阴性者,513例行阴道镜活检。以病理报告为金标准,比较HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA的宫颈病变检出率。对HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA单独筛查及分别联合TCT筛查CIN2+(包括CIN2、CIN3及宫颈癌)的效能进行比较。对HPV-DNA与HPV E6/E7 mRNA分流ASC-US的效能进行比较。结果HPV-DNA CIN1检出率4.08%高于HPV E6/E7 mRNA的2.45%,差异有统计学意义(χ^(2)=8.787,P=0.003),而两种筛查方法CIN2+检出率差异无统计学意义(χ^(2)=0.250,P=0.617)。HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA筛查CIN2+的灵敏度为85.98%vs.81.09%、特异度为49.57%vs.84.24%,HPV-DNA的筛查灵敏度高于E6/E7 mRNA、特异度低于E6/E7 mRNA,两种筛查方法的特异度、阳性预测值及假阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=94.732、32.802、94.732,P=0.000)。TCT联合HPV-DNA和TCT联合HPV E6/E7 mRNA筛查CIN2+的灵敏度为94.51%vs.90.85%、特异度为85.37%vs.90.26%,联合TCT提高了筛查的灵敏度和特异度,但TCT联合HPV-DNA的筛查特异度仍低于TCT联合HPV E6/E7 mRNA,两种联合筛查方法的特异度和假阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=3.871、3.871,P=0.049)。HPV E6/E7 mRNA在ASC-US中筛查CIN2+的ROC曲线下面积为0.814,大于HPV-DNA的0.704,差异有统计学意义(χ^(2)=2.352,P<0.05)。结论与HPV-DNA相比,HPV E6/E7 mRNA单独筛查及分别与TCT联合筛查CIN2+均有更高的特异度,对ASC-US的分流管理更具优势。

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA筛查宫颈病变研究进展

宫颈癌筛查的目的是早期发现、早期诊断和早期治疗宫颈癌前病变和早期宫颈癌。目前宫颈癌筛查有局限性,细胞学检查特异性强,但敏感度差;人乳头瘤病毒(HPV)DNA检查敏感度高,但特异性差。HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈疾病早期筛查、宫颈病变发展及治疗后复发进展中具有较高的诊断敏感性及特异性,具有一定应用前景。该文总结了HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变筛查中的研究进展,为临床选择宫颈病变筛查方法提供参考。

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA预测宫颈锥切术后病变残留或复发的价值

目的 研究并分析人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA预测宫颈锥切术后病变残留或复发的价值。方法 选取郑州大学第五附属医院收治的因高级别宫颈上皮内瘤变接受宫颈锥切术并切缘阴性且随访完整的196例患者,术后3、6、12个月对所有患者进行随访,随访的内容包括薄层液基细胞学检查、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA,必要时行阴道镜下宫颈活检术、宫颈管搔刮术,对发现残留或复发的患者终止随访,并进行相关影响因素的回顾性分析。结果 随访过程中发现病变残留或复发患者共41例,相关因素分析结果显示,年龄≥45岁、术前HPV E6/E7 mRNA阳性患者术后病变残留或复发率高于年龄<45岁、阴性患者(P<0.05);宫颈锥切术后病变残留或复发与宫颈锥切方式及是否累及腺体等因素无关(P>0.05)。术后随访过程中HPV E6/E7 mRNA检测阳性者累计36例,残留或复发29例,HPV DNA检测阳性者累计73例,残留或复发36例;HPV E6/E7 mRNA检测与HPV DNA检测特异度和阳性预测值相比,差异有统计学意义(P<0.05),灵敏度与阴性预测值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HPV E6/E7 mRNA检测比HPV DNA具有更高的特异度和阳性预测值,HPV E6/E7 mRNA检测可有效预测宫颈锥切术后疾病复发或残留的风险,对宫颈病变进展发出预警,避免过度检查及治疗。

深圳市妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

目的检测深圳市宫颈癌患者癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列。方法采用PCR技术扩增1例在深圳生活17年宫颈癌HPV16型阳性患者组织中HPV16E6、E7基因,对其进行克隆、构建重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析。结果成功地克隆了HPV16E6、E7基因,测序分析表明克隆的HPV16E6、E7基因与GenBank收录的德国标准株相比完全一致。结论深圳市妇女宫颈癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列与德国标准株相同。

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因及其突变体转化活性的研究

为筛选出可用于研制HPV治疗性疫苗的HPV16型E6和E7基因突变体 ,故将HPV16型原型株 (德国株 )E6和E7基因及其各种突变体分别转染Balb/c3T3细胞 ,观察转染后的细胞在软琼脂培养中的集落形成能力和在裸鼠体内的成瘤能力。结果表明 ,单独转染和共转染HPV16野生型E6和E7基因的Balb/c3T3细胞系 ,在软琼脂中呈集落样生长 ,并在裸鼠体内成瘤 ;而转染E6基因突变体mE6 (5 0G)、E7基因的两种突变体mE7- 1(2 4G2 6G)和mE7- 3(2 4G2 6G6 7R)以及共转染mE6和mE7- 1的Balb/c3T3细胞 ,在软琼脂培养中极少形成集落 ,也不能在裸鼠体内成瘤。提示经结构改造后的HPV16E6和E7基因已失去了对Balb/c3T3细胞的转化活性 ,而保留了免疫原性 ,可用于HPV16相关肿瘤治疗性疫苗的构建。

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析

目的分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别，选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因，将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体，进行双向测序、分析。结果构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒，命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。ＤＮＡ序列分析表明，该序列全长７７６ｂｐ，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第５５７位核苷酸“Ｔ”变为“Ｃ”，即Ｅ６的终止密码子ＴＡＡ变为谷氨酰胺密码子ＣＡＡ。结论中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的基因结构与德国标准株ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因之间存在差异。

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。

人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的 克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法 将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果 限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论 成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV

人乳头瘤病毒致癌特性及其E6和E7蛋白致癌机制的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)是一种感染人的乳头瘤病毒科病毒,主要感染上皮细胞,其高危型别(主要是16和18型)可引起恶性肿瘤。高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合入细胞基因组,并由于其E2基因表达障碍不能有效抑制E6、E7基因转录而持续高表达E6和E7 2种癌蛋白。E6和E7蛋白可分别抑制P53蛋白和pRb蛋白的作用而使细胞周期失控,在细胞基因组受到损伤时细胞周期仍然向前进展;E6蛋白能通过影响多种凋亡调节蛋白或因子的表达而抑制细胞凋亡;E6蛋白和E7蛋白能协同作用上调端粒酶的表达而使细胞永生化;以上机制最终导致受感染细胞发生恶性转化或癌变。本文对HPV的致癌特性及其所表达的E6蛋白和E7蛋白扰乱细胞周期、抑制细胞凋亡并活化端粒酶使细胞永生化的致癌机制的研究进展进行了综述。

外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响

目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用。方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异。结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P<0.01)。结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件。

人乳头瘤病毒16型E6和E7癌基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响

人乳头瘤病毒的16型E6和E7癌基因已广泛用于建立哺乳动物的永生化细胞,但能否用于建立鸡的永生化细胞尚不清楚。试验究克隆人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7癌基因,分别构建这两个病毒癌基因的逆转录病毒表达载体,包装成逆转录病毒颗粒,感染鸡前脂肪细胞后,采用MTT比色法检测E6和E7基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响。结果表明,与对照组相比,E7基因显著促进鸡前脂肪细胞增殖,而E6基因则作用不明显。本研究为E6和E7基因在鸡细胞永生化研究奠定基础。

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。

人乳头瘤病毒癌基因E6和E7对细胞影响的研究进展

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要危险因素,HPV感染细胞可通过癌基因E6和E7靶向细胞途径引起多种细胞改变,主要包括调节细胞周期进展、逃避细胞凋亡、诱导DNA损伤、影响细胞代谢等,最终在细胞内发挥其致瘤作用。本文将主要对高危型人乳头瘤病毒癌基因E6和E7引起的细胞改变进行综述。

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒 16型 (humanpapillomavirustype16 ,HPV16 )E6E7融合基因 (fmE6E7) ,研制治疗HPV16相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后 ,插入真核表达质粒获得pVR10 12 fmE6E7,瞬时转染Cos 7细胞 ,免疫荧光法检测证实其表达后 ,在C5 7BL 6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫 ,5 1Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性 (cytotoxicTlymphocyte,CTL) ,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应 ,与单独野生型E7基因免疫相比 ,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。

高危型人乳头瘤病毒癌基因E6和E7调节细胞作用靶点的研究进展

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染与多种人类癌症密切相关,其中最典型的是宫颈癌。高危型HPV最重要的两个病毒癌基因为E6和E7,病毒基因组整合到宿主基因组是病毒癌基因E6和E7实现持续表达的一种方式。HPV癌基因E6和E7能够靶向宿主细胞途径,通过这些相互作用,导致HPV发挥其在细胞中的致癌作用。对于病毒癌基因E6和E7研究最充分的细胞靶点分别是p53和pRb,然而,最近的研究表明这两种病毒蛋白具有调节更多细胞作用靶点的能力,包括细胞中调节表观遗传标记和剪接变化的蛋白质等。高危型HPV E6和E7蛋白通过调节这些靶点使细胞发生过度增殖和致癌作用。

口腔鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16型转化基因E_7的检测

【目的】准确检测口腔鳞状细胞癌及正常口腔粘膜中人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)的感染状况 ,探讨人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌之间的关系。【方法】从 30例未经治疗的口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织及 30例健康志愿者正常口腔粘膜切取标本 ,液氮冷冻保存 ;常规提取组织DNA ,设计HPV16E7转化基因特异性引物 ,进行聚合酶链反应 ,对PCR结果进行检测 ,记录结果。【结果】 30例口腔鳞状细胞癌患者中检测到 11例HPV16阳性 ,感染率 36 7% ;30例正常对照组中检测到 4例HPV16阳性 ,感染率 11 1%。经 χ2 检验 ,两者差别有显著性。【结论】人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌有一定关系 ,但HPV16在人口腔鳞状细胞癌发生发展过程中所起的作用还有待进一步研究。

人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因在耻垢分枝杆菌中的表达

目的在耻垢分枝杆菌Mycobaterium smegmatis mc2155中表达人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因,为其重组BCG疫苗的研究奠定基础。方法采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG-E7C导入耻垢分枝杆菌(M.smegmatismc2155)中,通过卡那霉素抗性筛选经PCR鉴定的重组M.smegmatis mc2155,培养于middlebrook7H9 broth(M7H9)培养基中,并添加10%M7H9 enrichment ADC和0.05%Tween 80,37℃培养48 h^72 h,42℃诱导表达5 h,表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析。结果成功构建pBCG3000-E7C质粒,SDS-PAGE显示表达产物的分子质量单位约为6.5 ku,与预期理论值相符,Western blot分析表达产物能被宫颈癌患者血清识别。结论人类乳头瘤病毒16型E7C基因在M.smegmatis mc2155中成功表达。