新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中乳头瘤病毒16型E6基因的克隆和序列分析

为了分析新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因结构特点 ,从中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以宫颈癌活检组织标本DNA为模板进行PCR扩增 ,获得HPV16E6基因 ,将其克隆到pUCm T载体上 ,并对其进行基因全序列分析 .PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为 82 35 % (14/17) ;测序结果显示 ,新疆株HPV16E6基因全长 45 6bp ,大小与德国标准株一致 .E6基因的第 2 47位碱基发生T→G突变 ,并由此引起所编码的氨基酸亦发生改变 .上述结果表明 ,中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16E6的基因结构与德国标准株HPV16E6基因之间存在差异 .

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的 分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法 采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒 16型 (humanpapillomavirustype16 ,HPV16 )E6E7融合基因 (fmE6E7) ,研制治疗HPV16相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后 ,插入真核表达质粒获得pVR10 12 fmE6E7,瞬时转染Cos 7细胞 ,免疫荧光法检测证实其表达后 ,在C5 7BL 6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫 ,5 1Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性 (cytotoxicTlymphocyte,CTL) ,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应 ,与单独野生型E7基因免疫相比 ,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。

新疆哈萨克族食管癌组织中乳头瘤病毒16型E6E7基因的研究

为了解HPV16感染后E6E7基因变化在哈萨克族食管癌发病中的作用 ,以及HPV16E6E7基因与食管癌病理组织分级的关系 ,采用聚合酶链 (PCR)技术 ,检测 82例食管癌及癌旁正常食管粘膜组织中HPV 16E6E7基因差别。食管癌、癌旁正常粘膜组HPV16E6E7基因的检出率分别为 3 4. 15 % ( 14 /4 1)和 19. 5 1% ( 8/4 1) ,63 . 41% ( 2 6/4 1)和48. 78% ( 2 0 /4 1) ,差别均无显著性 (P >0 . 0 5 )。然而 ,在食管癌组织的高分化组、中低分化组中HPV16E6E7的检出率分别为 7. 69% ( 1/13 )和 46. 43 % ( 13 /2 8) ,3 8. 46% ( 5 /13 )和 75 % ( 2 1/2 8) ,差别均有统计学意义 (P <0 .0 5 )。提示HPV16E6E7基因与哈萨克族食管癌的发生及癌组织分级密切相关。

抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响

目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P<0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%。经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降。

人乳头瘤病毒16型E_6基因的T-A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应，可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白，拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ，按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中，置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下，用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ，免疫印迹实验表明，此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。

雌激素对人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响

目的:探讨雌激素对人乳头状瘤病毒16(HPV 16)型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响。方法:以不同浓度的17-β-雌二醇(E_2)处理人永生化表皮细胞系(Ha Cat)后,绘制其生长曲线,以细胞活性测定法(MTT)测定细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brd U)测定细胞周期时相。脂质体转染法将含HPV 16 E6基因的质粒转染入经不同药物处理后的细胞中,以Real-time PCR法测定细胞中该基因的表达。结果:浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2促进细胞数目的增加(P<0.05);浓度为10^(-8)~10^(-6) mol/L的E_2明显增强细胞活性(P<0.05);浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2使Ha Cat细胞的细胞周期时相缩短(P<0.05);不同浓度E_2处理组细胞周期的分布差异无统计学意义(P>0.05)。当Ha Cat细胞被HPV 16E6质粒转染,随着E_2浓度的增加,HPV 16 E6 m RNA表达明显增加(P<0.05)。结论:E_2可加速Ha Cat细胞生长与增殖,增加HPV 16 E6转染Ha Cat细胞的效率,E_2水平升高可能增加HPV感染的风险。

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因的原核表达

根据人乳头瘤病毒 16 (新疆株 ) E6基因编码序列设计引物 ,从含有 HPV16 E6基因的质粒中扩增出含 HPV16 E6基因的 DNA片段 ,该片段全长 4 5 0 bp,将所得片段与 p MD18- T载体连接 ,转化到 JM10 9大肠杆菌中 ,筛选的阳性克隆扩增后 ,提取质粒 DNA,用 Bam H I和 Sal I酶切 ,回收 4 5 0 bp的目的片段 ,定向克隆到 p ET2 8a中 ,转化 JM10 9受体菌 ,从 JM10 9受体菌中提出质粒 ,再转化到 BL2 1(DE3)中 ,筛选出转化体 ,用 IPTG诱导表达 ,在 PAGE上见到所表达的18k D的特异性的 HPV16 (新疆株 ) E6蛋白条带。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

人乳头瘤病毒16型E6蛋白高表达下调LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的将人乳头瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6转染巨噬细胞,观察E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响,为进一步研究HPV16E6蛋白的致病机制奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(-)/E6通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24h后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Western-blotting鉴定E6蛋白在巨噬细胞中的表达,ELISA检测pcDNA3.1(-)/E6转染的巨噬细胞不同时间(12、24及48h)培养上清液中TNF-α与IL-1β的含量,统计软件SPSS12.0分析所得数据。结果Western-blotting结果显示pcDNA3.1(-)/E6能在巨噬细胞中表达约18kD的目的蛋白,即E6蛋白;pcDNA3.1(-)/E6+LPS组培养上清中TNF-α与IL-1β的量明显低于巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组,pcDNA3.1(-)/E6+LPS组与巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论HPV16E6蛋白瞬时高表达下调LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β。

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗 ,首先将表达质粒 pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+ 进行同源重组 ,构建了痘苗重组病毒NTVJLac。再将表达质粒 pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组 ,构建了表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定。Southern杂交显示 ,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入。该重组病毒在人源细胞中不复制。Westernblot显示 ,重组病毒在人源TK-14 3细胞中能表达E6和E7蛋白。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体。方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A-HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上。结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础。

宫颈癌病人血清微小RNA-145表达及与人乳头瘤病毒16型感染的关系

目的探究宫颈癌病人血清微小RNA-145(miR-145)与人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染相关性。方法选取2015年5月至2019年5月三亚市中医院收治的宫颈癌病人83例,另选取同期在该院体检显示健康者83例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测所有入组者血清miR-145表达水平,采用多重PCR技术检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)DNA表达水平,采用logistic回归模型进行危险因素分析,采用Pearson法进行相关性分析,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)进行miR-145诊断价值分析。结果宫颈癌组病人流产次数>1比例、宫颈脱落细胞HPV16阳性率及HPV16 E6 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。宫颈癌组血清miR-145水平(0.37±0.11)显著低于对照组(1.02±0.31)(P<0.05)。宫颈癌高、中、低分化病人血清miR-145水平分别为(0.42±0.16)、(0.35±0.12)、(0.33±0.08),不同分化程度病人血清miR-145水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ/Ⅵ期病人血清miR-145水平分别为(0.45±0.14)及(0.29±0.07),有淋巴结转移及无淋巴结转移病人血清miR-145水平分别为(0.47±0.18)及(0.31±0.08),HPV16阴性及阳性病人血清miR-145水平分别为(0.44±0.15)及(0.32±0.09),FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴结转移、HPV16阳性病人血清miR-145水平明显低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移、HPV16阴性病人(P<0.05)。宫颈癌病人血清miR-145与宫颈脱落细胞中HPV16 E6 mRNA表达水平呈负相关(r=−0.372,P<0.05)。流产次数>1、HPV16阳性、miR-145低表达是影响宫颈癌发生独立危险因素(P<0.05)。结论宫颈癌病人血清miR-145水平降低,宫颈脱落细胞HPV16阳性及HPV16 E6 mRNA表达水平升高;miR-145通过与HPV16相互作用,影响宫颈癌发生发展。

人乳头瘤病毒-16E5蛋白的功能及E5蛋白与E6、E7蛋白的相互作用

人乳头瘤病毒（ HPV ）是一种双链环状小DNA病毒，与一些恶性肿瘤密切相关，95％的宫颈癌的病例中都能检测到人乳头状病毒，口腔舌癌中HPV感染占60％。目前已发现的HPV亚型有180余种，根据HPV感染部位的不同分为皮肤型和黏膜型，黏膜型又可分为高危型人乳头瘤病毒和低危型人乳头瘤病毒。高危型（常见HPV-16，18，31，32，58）与黏膜恶性病变（如宫颈癌和口腔鳞癌）关系密切，低危型（常见HPV-6，11）则常与良性病变（如尖锐湿疣）有关［1］。高危型人乳头瘤病毒因高致癌性现研究较多，其主要含有3个致癌基因，分别为E5、E6和E7。在宫颈癌中可检测到E6和E7蛋白的持续表达，并且已证实了E6和E7能引起各种细胞的永生化［2］，其机制是E6和E7分别抑制了p53和pRb的活性，从而引起正常组织细胞周期发生改变和细胞的恶性转化［3］。相对于E6和E7，E5蛋白因强疏水性和非免疫原性使其从蛋白水平上的检测难度加大，而且E5在细胞中表达水平较低，在肿瘤形成的早期阶段发挥作用，其本身也不能使人细胞永生化，在后期病毒基因整合到宿主时常常发生缺失［4］，不同的是也有学者在一些恶性的宫颈癌细胞中检测到E5基因和E5蛋白的表达［5］。这些都造成了对E5的结构和功能的研究受到限制。近年来关于 HPV-16 E5蛋白研究表明其可以通过多种机制（包括与E6、E7的互助）参与细胞的恶性转化。

新疆维、汉族宫颈鳞癌病变中HPV16 E6基因变异分析

目的分析新疆地区维、汉族妇女宫颈鳞癌组织中HPV16型E6基因的变异情况。方法从新疆地区5例维吾尔族妇女和5例汉族妇女宫颈活检组织中提取病毒基因组DNA,经反向膜杂交检测确定为HPV16单一感染。采用PCR技术扩增HPV16E6基因片段,克隆到pUC18-T载体中进行DNA测序。结果成功克隆了HPV16E6基因,DNA测序结果表明,与德国标准株相比,10例宫颈鳞癌组织中共检出12种E6基因突变类型,包括107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、178(T→G)、310(T→C)、321(T→C)、341(T→C)、350(T→G)、375(A→G)、410(T→A)、499(G→T)和548(A→G),其中178(T→G)和350(T→G)的突变频率较高,均为30%(3/10)。汉族和维吾尔族标本中共有的突变包括178(T→G)和350(T→G),仅存在于汉族标本的突变为107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、310(T→C)和499(G→T),仅发生在维吾尔族标本的突变为321(T→C)、341(T→C)、375(A→G)、410(T→A)和548(A→G)。结论与德国标准株比较,新疆维吾尔族、汉族宫颈癌患者中HPV16E6基因存在新的变异,其中178(T→G)和350(T→G)型基因变异为热点突变;新疆地区宫颈癌的高发可能与HPV16E6基因突变有关。

HPV16型E6、E7变异与宫颈癌发生发展的研究进展

宫颈癌是全球15~44岁女性中第二常见的恶性肿瘤,每年的死亡人数约为265 653人,在中国,宫颈癌的发生率及死亡率仍较高。高危型人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生的必要条件,HPV16是最常见的高危人乳头瘤病毒。HPV16编码的E6和E7蛋白在HPV相关的肿瘤中起关键作用。近年来的研究揭示了HPV16 E6、E7基因的变异引起氨基酸变化可影响E6、E7蛋白与p53、pRb的结合,进而与宿主细胞恶性转化相关。本文将对近年来HPV16 E6、E7变异在宫颈癌发生发展中的作用作一综述。

宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的表达纯化及血清抗体检测

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)是宫颈癌组织中最常见的高危HPV,其相应蛋白的血清抗体与宫颈癌的发生发展相关。本研究构建HPV16E6重组表达载体并表达纯化获得HPV16E6重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16E6血清抗体反应与宫颈癌的相关性。方法:将HPV16E6基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E6表达重组体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用异丙基硫代-$-D-半乳糖苷(isopropylthio-$-D-galactoside,IPTG)诱导表达。表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被ELISA板,检测正常女性、慢性宫颈炎患者和宫颈癌患者血清抗体。同时采用荧光偏振方法分型检测宫颈癌组织HPVDNA。结果:pRSET-16E6表达重组体的工程菌经IPTG诱导后可表达Mr24×103的HPV16E6组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的22.3%。表达形式为包涵体,重组蛋白纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实。80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者血清抗体阳性率分别为5.0%、6.5%和31.2%,宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率显著高于正常人(P<0.002)及慢性宫颈炎患者(P<0.01),而正常人与慢性宫颈炎患者间的差异无显著性。32例宫颈癌患者癌组织中,HPVDNA阳性率90.6%,HPV16DNA阳性率46.9%。HPV16DNA阳性组血清HPV16E6抗体阳性率(46.7%)高于阴性组(17.6%),但两组间的差异无显著性(P>0.05)。结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16E6融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率明显高于正常人和慢性宫颈炎患者。

宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析

目的分析泉州地区宫颈癌患者HPV16型E6/E7序列突变情况,探讨其与宫颈癌发生的相关性。方法取35例HPV16阳性的宫颈癌组织标本,采用PCR法扩增E6、E7全长基因。PCR产物直接测序,并与野生型序列进行比对。分析E6、E7基因的变异情况。结果 E6、E7基因的突变率分别为91.4%和89.2%。E6基因中有10个位点为错义突变,2个位点为无义突变。氨基酸突变频率最高的是D25E(77.1%)。E7基因中共发现5个突变位点,有2个位点为错义突变,3个位点为无义突变,突变频率最高是N29S和无义突变T846C(均为75.0%)。结论 HPV16E6、E7基因中最常见突变位点D25E、N29S和T846C可能与宫颈癌的发生密切相关,可为研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索。