宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的变异

探讨了HPV16E5基因突变与宫颈癌发病的关系。应用银染聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析对 5 0份人宫颈癌活检标本进行基因突变的筛查。PCR检测显示 ,5 0例宫颈癌组织中HPV16E5的检出率为30 % (15 / 5 0 ) ,其中 6例宫颈癌HPV16E5扩增片段在行SSCP分析时发现有泳动变位 ,突变率为 40 % (6 / 15 )。

人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。

人乳头瘤病毒16型E5转化基因的克隆及原核表达

目的建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系为进一步研究其致癌机理作准备。方法用PCR技术从HPV16质粒DNA中扩增出E5基因序列连接到pGEM-T载体,将阳性的重组pGEM-T用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切并回收目的片段连接到原核表达载体pGEX-2T,转化DH5α菌株。取工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果①经PCR、测序和双酶切鉴定认为HPV16E5正确插入上述表达载体,建立了该转化基因的无性繁殖系。②经IPTG诱导的pGEX-2T-E5质粒表达出约42KD的融合蛋白,分析含有约16KDHPV16E5蛋白,与预期含HPV16E5的融合蛋白分子量相符。结论①采用PCR克隆技术,扩增HPV16E5转化基因目的片段,将其克隆到pGEM-T载体在国内首次建立了HPV16E5转化基因的无性繁殖子。②成功构建HPV16E5基因的原核表达质粒,并表达出GST-E5融合表达蛋白。

人乳头瘤病毒16型E5蛋白的生物学活性研究进展

宫颈癌发病率位于女性肿瘤的第3位,全球每年有约27万女性死于宫颈癌。人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素,90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。HPV是一种乳头瘤空泡病毒,为球形DNA病毒,能引起皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种HPV,根据其致癌危险性不同可分为低危型（low-risk human papilloma virus,LR-HPV）和高危型（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）两大类。

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E5,分析E5在HeLa细胞及BALB/c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16 E5基因引物,PCR扩增E5基因,经BamHI、EcoRI酶切后将其连接入pcDNA3.1(+),PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3.1(+)/HPV16 E5转染HeLa细胞,利用RT-PCR测定HPV16 E5 mRNA表达。将6只BALB/c小鼠分为3组,分别取100 mg pcDNA3.1(+)/HPV16 E5、100 mg pcDNA3.1(+)、100 mL PBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果 PCR扩增得到252 bp HPV16 E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3.1(+)。构建的pcDNA3.1(+)/HPV16 E5在HeLa细胞表达大小为252 bp的HPV16 E5 mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16 E5蛋白。

人乳头瘤病毒16型E5蛋白功能的研究进展

人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白具有特殊的生物学活性,在宫颈癌发生过程中起重要作用。HPV16E5蛋白具有转化活性,并可增强E6和E7蛋白的致癌活性。E5蛋白的转化活性主要通过上皮生长因子受体(EGFR)信号上调发挥作用。近年来还发现,HPV16E5蛋白是影响免疫系统和炎症通路的关键因子,可能成为宫颈癌治疗的一个靶标。本文就HPV16E5蛋白当前的研究进展进行综述。

不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type,HPV)16型E5早期基因在临床宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及宫颈癌患者中的存在情况,判断HPV16E5是否能作为临床宫颈癌的早期诊断治疗靶点,以利进一步研究HPV16的致癌机制。方法:从临床标本中筛选出HPV16阳性标本61例,根据病理诊断分为5组(宫颈炎组、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌组),再应用PCR的方法分别测定各组组织中HPV16E5DNA的表达情况。结果:宫颈炎组E5DNA阳性率为58.33%,CINⅠ级为63.64%,CINⅡ级为70.00%,CINⅢ级为44.44%,宫颈癌为77.78%,各组间阳性率差异无统计学意义。结论:E5DNA不仅仅在宫颈癌早期存在,因而E5不能作为临床宫颈癌的早期诊断靶点,但可作为宫颈癌疫苗研究的靶点。

外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响

目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用。方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异。结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P<0.01)。结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件。

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。

人乳头瘤病毒16型E6通过微小RNA-504调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6通过微小RNA(miR)-504对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法将体外培养的SiHa细胞分为对照组、空载体组、E6过表达组、E6过表达+miR-NC组和E6过表达+miR-504组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HPV16 E6 mRNA和miR-504的表达;采用免疫印迹法检测HPV16 E6蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法、Transwell小室和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡情况。结果与对照组和空载体组比较,E6过表达组细胞中HPV16 E6蛋白和mRNA表达水平均明显升高,而miR-504表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,E6过表达组细胞增殖活力和侵袭能力明显升高,而细胞凋亡率降低(P<0.05);与E6过表达组和E6过表达+miR-NC组比较,E6过表达+miR-504组细胞中miR-504表达水平和细胞凋亡率明显升高,而细胞增殖活力和侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论HPV16 E6可能通过下调miR-504的表达促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭并抑制其细胞凋亡。

食管鳞癌组织中人乳头瘤病毒16、18型E6蛋白,P53,MDM2蛋白的表达及意义

目的 研究HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达及意义。方法 运用免疫组化SABC法 ,检测 30例食管鳞癌组织中HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白的表达。结果 30例食管鳞癌组织HPVl6、18E6蛋白检出 15例 ,阳性率为5 0 % ;P5 3蛋白检出 17例 ,阳性率为 5 6 .6 7% ;MDM2蛋白检出 6例 ,阳性率为 11.5 0 % ;HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白的检出与癌组织的分化程度密切相关。HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白共同表达阳性 12例 ,占 4 0 % ,有显著相关性 (P <0 .0 1) ;MDM2蛋白和P5 3蛋白的表达无相关性。

人乳头瘤病毒16型E5基因在宫颈癌发生进程中的动态研究

目的观察人乳头瘤病毒(HPV)16型E5基因在宫颈癌发生发展过程中的动态变化情况,探讨E5 mRNA在宫颈癌早期筛查中的临床意义。方法收集2015年9月至2017年12月在四川省妇幼保健院宫颈门诊就诊或行宫颈癌机会性筛查人群的宫颈病变组织石蜡标本49例(HPV阳性),按照FIGO标准将收集的宫颈病变标本进行分期:宫颈炎13例,宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ5例,CINⅡ18例,CINⅢ5例,宫颈癌8例。利用实时荧光定量PCR检测不同病理分级宫颈组织中E5基因的完整度及E5、E6、E7 mRNA的表达水平。结果在49例HPV16阳性感染患者中,CINⅠ宫颈病变组织中E5基因的完整度比宫颈炎、CINⅡ及宫颈癌组织更高(P<0.05);CINⅠ宫颈病变组织中E5基因完整度虽高于CINⅢ组织,但差异无统计学意义。不同病理级别标本中E5、E6、E7 mRNA的表达水平均在CINⅢ组织最高。与E6、E7 mRNA相比,E5 mRNA在宫颈病变的全过程中均呈现出优势表达状态(P<0.05),而E6、E7 mRNA的表达水平只在病变后期(CINⅢ和宫颈癌)有升高趋势。结论在HPV16阳性感染患者的病变组织中,E5基因的完整度可能与宫颈疾病的发生、发展有关。E5基因有望成为宫颈癌早期筛查的靶基因。

16型人乳头瘤病毒E5基因对永生化口腔上皮细胞EGFR、p21、p53和Rb基因表达的影响

目的分析16型人乳头瘤病毒E5基因(HPV16 E5)对永生化口腔上皮细胞(HIOEC)肿瘤相关基因表皮生长因子受体(EGFR)、p21、p53和Rb表达的影响,探究HPV16 E5在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的潜在作用机制。方法将含有目的基因HPV16 E5的慢病毒载体p LOV-E5及对照病毒载体p LOV-N分别转染HIOEC细胞,并筛选出各自稳定转染的细胞株。RT-q PCR和Western blot法分别检测EGFR、p21、p53和Rb基因mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法分析HPV16 E5对HIOEC细胞增殖活性的影响。结果p LOV-E5转染的HIOEC细胞中,p21和p53的mRNA转录水平较对照组显著提高(P=0.00、0.02),但EGFR的mRNA转录水平较对照组无明显变化;EGFR、p21和p53的蛋白表达水平较对照组均显著提高,Rb基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组均无明显变化。MTT法检测结果表明,p LOV-E5转染HIOEC的增殖活力较对照组显著提高(P=0.00)。结论 HPV16 E5可以促进HIOEC的增殖,同时上调EGFR、p21和p53在HIOEC中的表达水平。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中乳头瘤病毒16型E6基因的克隆和序列分析

为了分析新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因结构特点 ,从中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以宫颈癌活检组织标本DNA为模板进行PCR扩增 ,获得HPV16E6基因 ,将其克隆到pUCm T载体上 ,并对其进行基因全序列分析 .PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为 82 35 % (14/17) ;测序结果显示 ,新疆株HPV16E6基因全长 45 6bp ,大小与德国标准株一致 .E6基因的第 2 47位碱基发生T→G突变 ,并由此引起所编码的氨基酸亦发生改变 .上述结果表明 ,中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16E6的基因结构与德国标准株HPV16E6基因之间存在差异 .

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因及其突变体转化活性的研究

为筛选出可用于研制HPV治疗性疫苗的HPV16型E6和E7基因突变体 ,故将HPV16型原型株 (德国株 )E6和E7基因及其各种突变体分别转染Balb/c3T3细胞 ,观察转染后的细胞在软琼脂培养中的集落形成能力和在裸鼠体内的成瘤能力。结果表明 ,单独转染和共转染HPV16野生型E6和E7基因的Balb/c3T3细胞系 ,在软琼脂中呈集落样生长 ,并在裸鼠体内成瘤 ;而转染E6基因突变体mE6 (5 0G)、E7基因的两种突变体mE7- 1(2 4G2 6G)和mE7- 3(2 4G2 6G6 7R)以及共转染mE6和mE7- 1的Balb/c3T3细胞 ,在软琼脂培养中极少形成集落 ,也不能在裸鼠体内成瘤。提示经结构改造后的HPV16E6和E7基因已失去了对Balb/c3T3细胞的转化活性 ,而保留了免疫原性 ,可用于HPV16相关肿瘤治疗性疫苗的构建。

高危型人乳头瘤病毒16 E5基因对口腔肿瘤致病机制的研究进展

人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发病的重要危险因子之一,近些年研究表明其在口腔肿瘤及癌前病变中检出率也较高,提示其与口腔肿瘤发病有关。现有研究主要集中于其E6、E7基因的功能,其他基因涉及较少,本文对近年来兴起的对人乳头瘤病毒E5基因与口腔肿瘤关系的研究及进展作一简要综述。

人乳头瘤病毒16/18型E6蛋白在宫颈病变中的意义及对预后的预测价值

目的·探讨人乳头瘤病毒16/18型(HPV16/18)E6蛋白在不同级别宫颈病变组织中表达的临床意义及对疾病预后的预测价值。方法·采用免疫组化法检测10例正常宫颈组织、33例宫颈上皮内瘤变Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasiaⅠ,CINⅠ)组织、31例CINⅡ?-?Ⅲ组织、30例宫颈癌手术病理标本中HPV16/18 E6蛋白的表达,分析其表达差异、与宫颈癌临床病理特征及不同CIN疾病进展之间的关系。结果·HPV16/18 E6阳性表达率在CINⅠ、CINⅡ?-?Ⅲ、宫颈浸润癌中依次增强(χ~2=19.82,P=0.000)。HPV16/18E6在低分化、直径大于4 cm的宫颈癌肿瘤中阳性表达率增高(P=0.033,P=0.011)。HPV16/18 E6过表达程度与宫颈癌病理学分级、肿瘤直径、不良预后之间成正相关(r=0.456,P=0.011;r=0.578,P=0.000;r=0.645,P=0.000)。HPV16/18 E6阳性表达对CINⅠ、CINⅡ?-?Ⅲ、宫颈癌进展预测的灵敏度分别为100.00%、62.50%、43.75%,特异度分别为96.77%、91.30%、92.86%,诊断符合率分别为96.97%、83.87%、66.67%。结论·HPV16/18 E6蛋白在宫颈癌发生发展及不良预后中发挥了重要作用,对宫颈疾病进展具有良好的预测价值,且对CIN疾病分层管理具有指导意义。

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的 分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法 采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。