人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1(+)与pcDNA3.1(+)/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1(+)相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E2;转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。

食管鳞癌组织中人乳头瘤病毒16、18型E6蛋白,P53,MDM2蛋白的表达及意义

目的 研究HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达及意义。方法 运用免疫组化SABC法 ,检测 30例食管鳞癌组织中HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白的表达。结果 30例食管鳞癌组织HPVl6、18E6蛋白检出 15例 ,阳性率为5 0 % ;P5 3蛋白检出 17例 ,阳性率为 5 6 .6 7% ;MDM2蛋白检出 6例 ,阳性率为 11.5 0 % ;HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白的检出与癌组织的分化程度密切相关。HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白共同表达阳性 12例 ,占 4 0 % ,有显著相关性 (P <0 .0 1) ;MDM2蛋白和P5 3蛋白的表达无相关性。

人乳头瘤病毒18型E2蛋白抗体制备及鉴定

目的研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E2蛋白的生物学活性,制备人乳头瘤病毒18型E2蛋白特异性抗体。方法使用原核表达载体pET28a(+)中表达、镍螯合亲和层析胶体纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),Western Blot法和免疫组织化学法检测抗体特异性。结果ELISA法检测显示:抗E2抗血清稀释滴度可达1∶10000以上,并能通过Western Blot法和免疫组织化学法检测到真核细胞表达的HPV18E2蛋白,提示具有较高抗体滴度和较强特异性。结论以原核表达系统表达并纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备得到了多克隆抗体能够检测真核细胞表达的E2蛋白,为进一步研究HPV18E2提供了有用的工具。

乳腺癌患者人乳头状瘤病毒感染与癌组织凋亡相关蛋白雌激素受体、孕激素受体、表皮生长因子受体-2表达水平相关性分析

目的:探究乳腺癌患者人乳头状瘤病毒(HPV)感染与癌组织相关蛋白雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及表皮生长因子受体-2(C-erbB-2)表达水平之间关系。方法:选取宜都市人民医院2020年12月~2023年1月134例乳腺癌患者及同期56例乳腺良性病变患者为研究对象,所有患者均行手术治疗,手术期间收集患者病灶组织,术后病理检查测定组织中HPV感染率以及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、C-erbB-2蛋白表达情况,分析HPV感染与ER、PR、C-erbB-2表达情况之间关系。结果:乳腺癌组织HPV16/18感染率显著高于乳腺良性病变,差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌组织ER、PR阳性率低于乳腺良性病变,C-erbB-2蛋白阳性率显著高于乳腺良性病变,差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌HPV16/18感染患者ER阳性率、PR阳性率低于无HPV16/18感染患者,C-erbB-2阳性率高于无HPV16/18感染患者,差异有统计学意义(P<0.05);多元Logistic回归分析结果显示ER、PR、C-erbB-2阳性率是宫颈癌组织HPV16/18感染影响因素,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HPV感染、ER、PR、C-erbB-2表达与乳腺癌发病关系密切,HPV感染后其可能经由调节癌组织凋亡相关蛋白ER、PR、C-erbB-2表达水平介导乳腺癌发生以及进展。

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清。方法采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物。经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白。免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化。结果酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功。表达蛋白相对分子质量(M_r)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性。小鼠抗血清效价升高,CD4^+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高。结论成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清。

宫颈病变患者人乳头瘤病毒16亚型E2基因多态性检测

目的分析宫颈病变中人乳头瘤病毒（HPV）16亚型E2基因的多态与宫颈病变的关系,了解E2基因变异情况及其与宫颈病变的相关性。方法应用PCR和高分辨率熔解曲线方法针对379例HPV高危亚型阳性宫颈脱落细胞样本进行HPV16感染情况及HPV16亚型E2基因68位点和133位点多态分布情况进行检测。结果 379例HPV高危亚型阳性宫颈标本共检出78例HPV 16亚型阳性,其在宫颈癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ、炎症患者中的检出率分别为44.8%、31.5%、24.1%和9.6%;HPV16 E2基因68C和133G的频率在中重度宫颈内瘤样病变和宫颈癌中明显高于轻度上皮内瘤样病变和炎症患者（P〈0.05）。结论 HPV16是导致宫颈恶性病变的重要致病因素;随着病理类型的进展,HPV16感染率也逐渐增加;同时基因位点改变说明HPV 16 E2基因单核苷酸变异可能使致癌能力发生改变。

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法 ,对HPV5 81L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰 ,并保留氨基酸不变。选用非复制型重组痘苗病毒为载体 ,将修饰的L1基因 1 5kb和L2基因 1 4kb分别插入痘苗病毒表达载体 pJSD的 7 5k和H6早期启动子之后 ,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组。经单斑筛选纯化 ,获得共表达HPV5 8L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株。该病毒在CEF细胞上连续传至第15代 ,经斑点杂交分析 ,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;经Westernblot检测 ,重组病毒能稳定表达HPV5 81L1及L2蛋白。此结果为HPV5

重组人干扰素α-2b凝胶联合乳酸菌阴道胶囊对高危型人乳头瘤病毒感染患者阴道微生态的影响

目的探讨重组人干扰素α-2b凝胶联合乳酸菌阴道胶囊治疗高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染患者的临床疗效。方法选取2019年4月至2021年2月南昌三三四医院收治的88例HR-HPV感染者作为研究对象,按照随机数字表法分为观察组与对照组,每组44例。对照组采用重组人干扰素α-2b凝胶治疗,观察组在对照组基础上联合乳酸菌阴道胶囊治疗,比较两组临床疗效、阴道微生态恢复情况、免疫因子、不良反应发生情况及生命质量。结果观察组治疗总有效率为90.91%,高于对照组的70.45%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组阴道微生态正常或恢复率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,观察组白细胞介素(IL)-4水平低于对照组,IL-12、干扰素γ(IFN-γ)水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应发生率比较差异无统计学意义。治疗后,两组健康调查简表(SF-36)评分均高于治疗前,且观察组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组人干扰素α-2b凝胶联合乳酸菌阴道胶囊治疗HR-HPV感染确切疗效,可有效促进患者阴道微生态平衡恢复,改善免疫因子水平,提升患者生命质量,且不良反应发生率较低,安全性较高。

人乳头瘤病毒52型E2和E6/E7在宫颈病变中的表达及其意义

目的观察人乳头瘤病毒52型(human papillomavirus 52,HPV52)E2及E6/E7m RNA在宫颈癌及癌前病变组织中的表达以及高危型HPV分布情况,探讨HPV52感染及E2、E6/E7表达在宫颈癌发生发展中的临床意义。方法收集512例高危型HPV阳性病例,依据病理学诊断归入非典型鳞状上皮细胞病变组(atypical squamous cell lesions,ASC)、低度鳞状上皮内病变组(low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL组)、高度鳞状上皮内病变组(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)以及鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)。以实时荧光定量PCR方法检测124例HPV52阳性样本E2及E6/E7 m RNA,并进行卡方检验及Spearman相关性分析。结果 HPV52型E2与E6/E7m RNA呈负相关,rs=-0.98,P<0.01,两者检出率在组间有统计学差异(P<0.05)。在13种高危型HPV中,检出率最高前三位为HPV52(24.2%)、HPV58(20.5%)、HPV16(11.7%)。结论 HPV52型E2缺失、E6/E7表达过度是宫颈癌变的关键环节,E2、E6/E7水平在评估宫颈病变程度中具有参考价值。同时,HPV52型在宫颈癌的发展其作用值得进一步研究。

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18,HPV18)E2基因插入到原核表达载体pET28a(+)T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础。方法1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2;2)PCR、限制性内切酶酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a(+)-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达。结果1)PCR、限制性内切酶酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2的成功构建;2)SDS-PAGE电泳分析,HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符。结论1)成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白。

人乳头瘤病毒11型E6基因与人IFN-α2b融合基因原核表达质粒的构建与鉴定

目的构建HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体,为进一步原核表达奠定基础。方法在IFNα2b的起始密码子之前加入ccatggct,同时以编码(GGSGS)3的45个碱基序列取代其终止密码子,将改造后的人IFNα2b基因人工合成,然后将其装入质粒pET32a的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间;PCR扩增HPV11E6基因片段。将含有IFNα2b基因片段的质粒pET32a和含有BamHⅠ,EcoRⅠ酶切位点的HPV11E6同时用BamHⅠ,EcoRⅠ酶切,将酶切产物纯化回收后做连接反应,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定,同时将挑选的阳性克隆菌液送公司测序。结果测序结果表明成功的将HPV11E6和人IFNα2b通过连接肽(GGSGS)3连接并装入pET32a的NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间,且基因序列与设计完全一致。结论HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体的成功构建,为进一步原核表达奠定了基础。

HPVL1蛋白、TRIM22、HER-2联合检测在HPV阳性宫颈上皮内瘤变中的早期诊断价值

目的 探讨人乳头瘤病毒LI(HPVL1)蛋白、三结构域家族蛋白22(TRIM22)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)联合检测在人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈上皮内瘤变(CIN)中的早期诊断价值。方法 回顾性选取2021年1月至2023年6月承德医学院附属医院就诊的162例薄层液基细胞学(TCT)检查异常且HPV阳性的CIN患者为研究组,另选取同期经组织病理学诊断为正常宫颈组织的138名对象为对照组。免疫组织化学法检测宫颈组织中HPVL1蛋白、TRIM22、HER-2表达。比较对照组、研究组组织中HPVL1蛋白、TRIM22、HER-2表达,并比较不同分级CIN患者HPVL1蛋白、TRIM22、HER-2表达。多因素Logistic回归模型分析CIN发生的影响因素;受试者操作特征(ROC)曲线分析HPVL1蛋白、TRIM22、HER-2表达对CIN的早期诊断价值。结果 研究组组织中HPVL1蛋白及TRIM22蛋白阳性率分别为34.57%、32.72%,均显著低于对照组(74.64%、71.01%),HER-2阳性率为60.49%,显著高于对照组(10.87%),差异均有统计学意义(P<0.05)。CINⅠ级、CINⅡ级和CINⅢ级HPVL1蛋白和TRIM22阳性率呈下降趋势,HER-2阳性率呈上升趋势(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,宫颈组织中HPVL1蛋白、TRIM22及HER-2表达均为CIN的影响因素(OR=5.110、5.231、9.652,P<0.05)。ROC曲线结果显示,HPVL1蛋白表达诊断CIN的曲线下面积(AUC)为0.700,敏感度为65.43%;TRIM22表达诊断CIN的AUC为0.691,敏感度为67.28%;HER-2表达诊断CIN的AUC为0.748,敏感度为60.49%。三者联合诊断CIN的AUC为0.814,显著高于单独诊断的AUC(P<0.05)。结论 宫颈组织中HPVL1蛋白、TRIM22及HER-2表达影响CIN的发生、发展,三者联合对CIN具有较高的诊断价值。

人乳头瘤病毒6b型晚期蛋白L_2免疫反应表位的确定

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）含有２个晚期开放读码框（ＯＲＦ），Ｌ＿２ＯＲＦ编码的蛋白具有型特异性。本研究用能表达产生完整ＨＰＶ６ｂＬ＿２蛋白的质粒ｐ６ｂＬ＿２ＮＸ，采取核酸外切酶Ⅲ定向连续次级克隆的方法，制备了一系列一端逐渐删切的ＤＮＡ片段，诱生一组从Ｃ端至Ｎ瑞依次减少的Ｌ＿２蛋白与相应血清作免疫印迹实验，最小的仍保持阳性反应的多肽即含有抗原表位，实验结果ＨＰＶ６ｂＬ＿２蛋白的核酸编码区位于５４８１－５５０６之间，其相应氨基酸序列是ＥＰＧＩＮＰＴＱ。

人乳头瘤病毒E2蛋白及其相关疫苗

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染在全球范围内颇为常见,其与肛门生殖器疣、生殖器肿瘤的发生关系密切。研究发现,乳头瘤的形成与HPVE2蛋白密不可分,该蛋白质涉及到病毒生命周期的各个阶段,与病毒的有丝分裂、其他早期蛋白的转录及细胞凋亡有关。近年来,各国学者利用E2蛋白的特性研制出E2相关疫苗,分别使用不同的重组病毒来传输E2,或是使用纯化的E2蛋白或E2融合蛋白,运输至体内的HPV转化细胞和/或HPV感染细胞中,以期达到防治HPV感染相关疾病的目的。

牛乳头瘤病毒蛋白E2／靶DNA结合区结构研究

乳头瘤病毒（ＰＶ）转录的主要调节因子是Ｅ２蛋白。在人乳头瘤病毒中，Ｅ２蛋白调节癌基因Ｅ６和Ｅ７的表达。Ｅ２行使功能的方式是与靶ＤＮＡ的一段由１２个碱基对组成的回文序列（Ｅ２－ＢＳ）发生特异的相互作用。因此，阐明Ｅ２蛋白对靶ＤＮＡ的选择性立体化学机制是研究此类致癌病毒转录调节的关键。牛ＰＶ－１（ＢＰＶ－１）Ｅ２蛋白的靶ＤＮＡ结合区的晶体结构显示出一种新的二聚体形式蛋白／ＤＮＡ结合方式。蛋白质为二聚体β－折叠桶，其外表面为起识别作用的α－螺旋。ＤＮＡ／蛋白界面上分布着复杂交织的氢键网，ＤＮＡ光滑地环绕于Ｅ２β－折叠桶上。

马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析

为调查马源人乳头瘤病毒(HPV)23型(HPV-23)在马群中的流行及遗传变异情况,本研究对413份马流产胎儿组织和20份马场工人鼻拭子样品经PCR检测,结果显示,在纯血马和伊犁马流产胎儿组织样品中均检出HPV-23,阳性率分别为4.3%(2/46)和9.3%(34/367),表明马流产胎儿携带HPV-23,该病毒可能导致马的流产;在马场工人鼻拭子样品中也检出HPV-23,阳性率为60%(12/20)。将其中12份检测为HPV-23阳性的样品进行E2基因的PCR扩增测序后,采用MegAlign7.1.0软件分析本研究获得的HPV-23 E2基因与GenBank中相关病毒参考株E2基因的同源性,并采用MEGA7.0.26软件构建人源与马源HPV-23 E2基因的进化树,分析其遗传进化特征。同源性分析结果显示,本研究测序的8株马源及4株人源HPV-23 E2基因与氨基酸序列的同源性均为100%,与国外2株人源HPV-23 E2基因序列的同源性为98.9%~99.2%,提示马源HPV-23可能来源于人。遗传进化分析显示,本研究鉴定的马源及人源HPV-23与国外人源HPV-23形成独立进化分支,且同处于β进化分支,与马乳头瘤病毒处于不同分支,进一步表明马源HPV-23可能来源于人。本研究首次在马流产胎儿组织中检测到HPV-23,提示该病毒可能导致马的流产,可能是人源HPV-23感染马,该结果为动物源HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。

新疆地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒16型E1、E2的遗传变异分析

目的新疆是宫颈癌高发的地区之一,人乳头瘤病毒的基因变异可能会增加其感染人体的风险并增强该病毒介导的免疫逃逸能力,HPV(Human Papillomavirus)16 E1、E2是病毒在转录及复制过程中的重要蛋白质,E1、E2核苷酸位点的突变可能导致蛋白质的改变,从而影响宫颈癌的发生发展。方法收集80例HPV16感染阳性宫颈粘液样本,提取DNA后进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物进行一代测序,并对E1、E2基因进行进化学分析,了解HPV16在新疆地区的基因多态性,统计病理信息分析相关突变位点与宫颈癌的进展关系。结果80个HPV16阳性样本中,E1发生突变的样本有34个,发生核苷酸突变的位点有25个,(11个错义突变,14个同义突变)。HPV16 E2发生突变的样本有53个,发生核苷酸突变的位点有14个,(11个错义突变,3个同义突变)。在HPV16 E1上常见的核苷酸突变位点为A978G(14/80)、G1473A(10/80)所对应的氨基酸改变为I326M、M491I,在HPV16 E2上常见的核苷酸突变位点为C2295A(14/80)、C2546T(20/80),所对应的氨基酸改变为T135K、P219S。结论由系统发育树结果可看出有77个样本属于欧洲株,3个样本属于亚洲株。没有发现非洲株和北美/亚裔株。

新疆维吾尔自治区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒16型E4和L2的遗传变异分析

目的探讨人乳头瘤病毒16(HPV16)E4、L2基因变异及氨基酸变化,分析HPV16的进化特征。方法从医院收集40例HPV16感染阳性的宫颈脱落细胞样本和40例宫颈组织细胞样本,提取样本的病毒DNA,对40例宫颈脱落细胞的DNA进行HPV16 E4和L2 Sanger测序及对40例宫颈组织细胞DNA高通量测序,构建HPV16 E4和L2基因系统进化树,分析HPV16 E4和L2基因的变异特征。结果有72个HPV16 E4变异样本,10个核苷酸变异位点(4种错义变异和7种同义变异),74个HPV16 L2变异样本,40个核苷酸变异位点(23种错义变异和18种同义变异)。宫颈癌(CC)中T4177C、A4288C、A4654C变异频率明显高于非宫颈癌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论①新疆维吾尔自治区主要流行病毒株为欧洲株,少数为亚洲株。②HPV16 L2基因中T4177C、A4288C、A4654C在宫颈癌中的变异频率高于非宫颈癌,且G4181A与亚洲株相关。