死亡相关蛋白激酶1、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶甲基化状态检测及与宫颈癌人乳头瘤病毒16感染的关系

目的检测宫颈癌组织死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子区域甲基化状态,初步探讨其甲基化状态与宫颈癌人乳头瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法选取宫颈癌患者103例为宫颈癌组,另选取同期年龄相匹配的慢性子宫颈炎患者110例为对照组。检测2组宫颈脱落组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化状态。通过人乳头瘤病毒检测HPV16感染情况,分析宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化与HPV16感染相关性。结果与对照组相比,宫颈癌组患者HPV16感染阳性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,宫颈癌组DAPK1、KLF4、MGMT基因异常甲基化率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度低、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移患者宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT甲基化率高于分化程度高、中及TNM分期Ⅰ~Ⅱ、无淋巴结转移、无远处转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。与HPV16感染阴性相比,HPV16感染阳性患者中APK1、KLF4、MGMT甲基化比例升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16感染情况与APK1、KLF4、MGMT甲基化相关(r=0.454,0.497,0.307,P<0.05)。结论HPV16感染可能与APK1、KLF4、MGMT甲基化有关,HPV16感染可能通过影响APK1、RAR-β、MGMT基因甲基化促进宫颈癌的发展。

孕妇人乳头瘤病毒6型-DNA荧光定量PCR检测

目的:旨在检测泉州地区孕妇人乳头瘤病毒感染情况,并探讨其流行特点。为进一步阻断传染源,降低发病率,提高临床诊疗水平,提供有价值的量化指标。方法:应用实时荧光定量PCR新技术对泉州地区1000例孕妇宫颈分泌物人乳头瘤病毒6型-DNA,进行量化检测。结果:检测阳性患者384例,阳性率为38.4%(384/1000),患者每毫升拷贝数的范围位于1.10×102～8.56×108之间。结论:检测结果显示孕妇人乳头瘤病毒感染率较高,为38.4%。相对目前国内检测方法,该方法是目前检测孕妇HPV感染的比较敏感、特异、快速、正确、可靠、稳定的技术。

人乳头瘤病毒16型E6蛋白高表达下调LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的将人乳头瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6转染巨噬细胞,观察E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响,为进一步研究HPV16E6蛋白的致病机制奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(-)/E6通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24h后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Western-blotting鉴定E6蛋白在巨噬细胞中的表达,ELISA检测pcDNA3.1(-)/E6转染的巨噬细胞不同时间(12、24及48h)培养上清液中TNF-α与IL-1β的含量,统计软件SPSS12.0分析所得数据。结果Western-blotting结果显示pcDNA3.1(-)/E6能在巨噬细胞中表达约18kD的目的蛋白,即E6蛋白;pcDNA3.1(-)/E6+LPS组培养上清中TNF-α与IL-1β的量明显低于巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组,pcDNA3.1(-)/E6+LPS组与巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论HPV16E6蛋白瞬时高表达下调LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β。

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果:克隆出HPV11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7。本研究克隆出的HPV11E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化。结论:本研究克隆出的HPV11E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。

人乳头瘤病毒52型E2和E6/E7在宫颈病变中的表达及其意义

目的观察人乳头瘤病毒52型(human papillomavirus 52,HPV52)E2及E6/E7m RNA在宫颈癌及癌前病变组织中的表达以及高危型HPV分布情况,探讨HPV52感染及E2、E6/E7表达在宫颈癌发生发展中的临床意义。方法收集512例高危型HPV阳性病例,依据病理学诊断归入非典型鳞状上皮细胞病变组(atypical squamous cell lesions,ASC)、低度鳞状上皮内病变组(low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL组)、高度鳞状上皮内病变组(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)以及鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)。以实时荧光定量PCR方法检测124例HPV52阳性样本E2及E6/E7 m RNA,并进行卡方检验及Spearman相关性分析。结果 HPV52型E2与E6/E7m RNA呈负相关,rs=-0.98,P<0.01,两者检出率在组间有统计学差异(P<0.05)。在13种高危型HPV中,检出率最高前三位为HPV52(24.2%)、HPV58(20.5%)、HPV16(11.7%)。结论 HPV52型E2缺失、E6/E7表达过度是宫颈癌变的关键环节,E2、E6/E7水平在评估宫颈病变程度中具有参考价值。同时,HPV52型在宫颈癌的发展其作用值得进一步研究。

人乳头瘤病毒16型E_6基因的T-A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应，可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白，拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ，按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中，置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下，用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ，免疫印迹实验表明，此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。

Reid阴道镜评分、HPV E6/E7 mRNA表达量在宫颈癌中的临床应用价值研究

目的研究Reid阴道镜评分(以下简称Reid评分)、高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)mRNA表达量与宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)分期、血清常规肿瘤标志物水平的相关性及对宫颈癌术后淋巴结转移的预测价值。方法选取2021年3月至2022年5月在菏泽市立医院就诊的100例宫颈癌患者作为宫颈癌组,另选同期诊治的50例低级别鳞状上皮内病变(LSIL)患者作为LSIL组,50例高级别鳞状上皮内病变(HSIL)患者作为HSIL组。比较3组Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量及血清常规肿瘤标志物[糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)]水平;分析宫颈癌组Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量与血清常规肿瘤标志物水平及宫颈癌FIGO分期的相关性;根据宫颈癌组患者术后随访结果分为术后有淋巴结转移和无淋巴结转移,比较有无淋巴结转移患者Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量及血清CA125、CEA水平,分析Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量对宫颈癌术后淋巴结转移的预测价值。结果宫颈癌组Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量及血清CA125、CEA水平均高于HSIL组、LSIL组(P<0.05);HSIL组Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量及血清CA125、CEA水平均高于LSIL组(P<0.05)。宫颈癌患者Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量与血清CA125、CEA水平均呈正相关(r=0.405~0.705,P<0.05)。Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量与宫颈癌FIGO分期呈正相关(r=0.415、0.501,P<0.05)。宫颈癌组术后淋巴结转移患者的Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量及血清CA125、CEA水平均高于无淋巴结转移的患者(P<0.001)。Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量、CA125、CEA预测宫颈癌术后淋巴结转移的曲线下面积(AUC)分别为0.756(95%CI:0.657~0.838)、0.760(95%CI:0.662~0.841)、0.803(95%CI:0.710~0.877)、0.768(95%CI:0.670~0.848)。将CA125、CEA联合检测作为常规预测方案,Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量、CA125、CEA联合检测作为新预测方案,常规预测方案预测宫颈癌术后淋巴结转移的曲线下面积(AUC)为0.826(95%CI:0.724~0.889),新预测方案预测宫颈癌术后淋巴结转移的AUC为0.955(95%CI:0.892~0.987),新预测方案预测的AUC明显大于常规预测方案(Z=1.981,P=0.045)。与常规预测方案比较,新预测方案的净重新分类指数为0.021(95%CI:0.015~0.039)、综合判别改善指数为0.046(95%CI:0.033~0.069),均P<0.05。结论Reid评分、HPV E6/E7 mRNA表达量与宫颈癌FIGO分期及血清CEA、CA125水平相关,且在预测宫颈癌术后淋巴结转移方面具有一定价值。

宫颈癌病人血清微小RNA-145表达及与人乳头瘤病毒16型感染的关系

目的探究宫颈癌病人血清微小RNA-145(miR-145)与人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染相关性。方法选取2015年5月至2019年5月三亚市中医院收治的宫颈癌病人83例,另选取同期在该院体检显示健康者83例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测所有入组者血清miR-145表达水平,采用多重PCR技术检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)DNA表达水平,采用logistic回归模型进行危险因素分析,采用Pearson法进行相关性分析,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)进行miR-145诊断价值分析。结果宫颈癌组病人流产次数>1比例、宫颈脱落细胞HPV16阳性率及HPV16 E6 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。宫颈癌组血清miR-145水平(0.37±0.11)显著低于对照组(1.02±0.31)(P<0.05)。宫颈癌高、中、低分化病人血清miR-145水平分别为(0.42±0.16)、(0.35±0.12)、(0.33±0.08),不同分化程度病人血清miR-145水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ/Ⅵ期病人血清miR-145水平分别为(0.45±0.14)及(0.29±0.07),有淋巴结转移及无淋巴结转移病人血清miR-145水平分别为(0.47±0.18)及(0.31±0.08),HPV16阴性及阳性病人血清miR-145水平分别为(0.44±0.15)及(0.32±0.09),FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴结转移、HPV16阳性病人血清miR-145水平明显低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移、HPV16阴性病人(P<0.05)。宫颈癌病人血清miR-145与宫颈脱落细胞中HPV16 E6 mRNA表达水平呈负相关(r=−0.372,P<0.05)。流产次数>1、HPV16阳性、miR-145低表达是影响宫颈癌发生独立危险因素(P<0.05)。结论宫颈癌病人血清miR-145水平降低,宫颈脱落细胞HPV16阳性及HPV16 E6 mRNA表达水平升高;miR-145通过与HPV16相互作用,影响宫颈癌发生发展。

成都市58650名妇女宫颈人乳头状瘤病毒HPV6/11,HPV16/18感染状况研究

人类乳头状瘤病毒（HPV）是一种小分子双链DNA病毒,对人皮肤、黏膜有高度亲嗜性。目前,已经鉴定出的HPV约有150种亚型,根据其致病性大小分为低危型和高危型。低危型HPV6和HPV11致尖锐湿疣最主要的基因型,尖锐湿疣治愈后容易复发,随着病程迁延,复发次数增多,尖锐湿疣患者也可能导致癌变;高危型中的HPV16、18在世界范围内始终是引起宫颈癌变的最重要的亚型。

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗 ,首先将表达质粒 pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+ 进行同源重组 ,构建了痘苗重组病毒NTVJLac。再将表达质粒 pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组 ,构建了表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定。Southern杂交显示 ,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入。该重组病毒在人源细胞中不复制。Westernblot显示 ,重组病毒在人源TK-14 3细胞中能表达E6和E7蛋白。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。

阴道炎患者HPV6/11-DNA定量分析

目的 了解女性阴道炎患者人乳头瘤病毒 6 / 11型 (HPV6 / 11)的感染情况。方法 荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)技术检测 2 5 8例门诊患者阴道分泌物中HPV6 / 11的病毒拷贝数。结果 共检出HPV6 / 11阳性者 94例 ,阳性率 36 .43 % ,拷贝数在 10 5以上者 78例 ,占阳性者中 82 .98% ,40岁以上年龄组阳性率高且病毒复制量均在10 5以上。结论 ①中老年阴道炎患者就诊晚 ,感染重。②FQ PCR检测HPV敏感、快速、准确 。

人乳头瘤病毒-16E5蛋白的功能及E5蛋白与E6、E7蛋白的相互作用

人乳头瘤病毒（ HPV ）是一种双链环状小DNA病毒，与一些恶性肿瘤密切相关，95％的宫颈癌的病例中都能检测到人乳头状病毒，口腔舌癌中HPV感染占60％。目前已发现的HPV亚型有180余种，根据HPV感染部位的不同分为皮肤型和黏膜型，黏膜型又可分为高危型人乳头瘤病毒和低危型人乳头瘤病毒。高危型（常见HPV-16，18，31，32，58）与黏膜恶性病变（如宫颈癌和口腔鳞癌）关系密切，低危型（常见HPV-6，11）则常与良性病变（如尖锐湿疣）有关［1］。高危型人乳头瘤病毒因高致癌性现研究较多，其主要含有3个致癌基因，分别为E5、E6和E7。在宫颈癌中可检测到E6和E7蛋白的持续表达，并且已证实了E6和E7能引起各种细胞的永生化［2］，其机制是E6和E7分别抑制了p53和pRb的活性，从而引起正常组织细胞周期发生改变和细胞的恶性转化［3］。相对于E6和E7，E5蛋白因强疏水性和非免疫原性使其从蛋白水平上的检测难度加大，而且E5在细胞中表达水平较低，在肿瘤形成的早期阶段发挥作用，其本身也不能使人细胞永生化，在后期病毒基因整合到宿主时常常发生缺失［4］，不同的是也有学者在一些恶性的宫颈癌细胞中检测到E5基因和E5蛋白的表达［5］。这些都造成了对E5的结构和功能的研究受到限制。近年来关于 HPV-16 E5蛋白研究表明其可以通过多种机制（包括与E6、E7的互助）参与细胞的恶性转化。

HPV E6/E7 mRNA检测联合液基细胞学检查对宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级术后的随访价值

目的探讨HPV E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查(TCT)在宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ~Ⅲ级术后复发的诊断价值。方法分析358例CIN II^III级患者的临床资料,并对其进行随访,术后3、6、12、18、24个月行TCT、高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)DNA及HPV E6/E7 mRNA。在术后第12月随访时,对这三项检测中至少一项阳性的患者行组织病理学检查,评价宫颈病变复发情况。结果术后3~18月HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA阴性率呈逐渐升高趋势,但术后24月HR-HPV DNA较术后18月略有下降。TCT阴性率在术后12月最低,术后24月最高。TCT、HPV E6/E7 mRNA联合检测与TCT、HR-HPV DNA联合检测的灵敏度比较,差异无统计学意义(χ2=2.50,P>0.05),而TCT、HPV E6/E7 mRNA联合检测的特异性较TCT、HR-HPV DNA联合检测高,差异有统计学意义(χ2=18.60,P<0.05)。结论 HPV E6/E7 mRNA联合TCT检测可提高CINⅡ~Ⅲ级患者术后复发的诊断准确性。

高危型HPV感染宫颈病变中E6/E7 mRNA的表达水平

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 m RNA检测对高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染宫颈病变筛查的临床价值。方法选择265例HR-HPV感染者,其中100例病理结果为正常宫颈/慢性炎症(对照组),88例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级,33例CINⅡ级,28例CINⅢ级,16例宫颈癌患者的宫颈脱落细胞标本,采用支链DNA(b-DNA)技术检测HPV E6/E7 m RNA的表达情况。结果 CINⅡ级(81.82%)、CINⅢ级(89.29%)、宫颈癌组(100.00%)的HPV E6/E7 m RNA阳性率高于对照组(20.00%)和CINⅠ级(35.23%),差异有统计学意义,其余各组间比较差异无统计学意义;CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈癌组的HPV E6/E7 m RNA表达量也高于对照组和CINⅠ级,差异有统计学意义,其余各组间比较差异无统计学意义;高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)和癌组的HPV E6/E7 m RNA阳性率及表达量显著高于正常、非典型鳞状细胞(ASC)和低级别鳞状上皮内瘤变(LSIL)组(P<0.05)。结论 HPV E6/E7 m RNA的表达可能提示了病毒的活性和病变的进展程度,可能成为筛查出高级别宫颈病变的有效指标,可以作为宫颈癌前病变筛查的辅助方法。

高危型人类乳头瘤病毒E7促进宫颈癌变的分子机制研究进展

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。WHO于1992年宣布HPV病毒是引起宫颈癌变的首要因素。研究显示E6、E7癌蛋白分别使肿瘤抑癌基因p53和pRb失去活性，最终引起细胞生长失控，发生癌变。在已存在E6基因基础表达的HPV16感染细胞中，持续的E7基因表达对宫颈癌的维持是必要的。高危型HPV病毒的E7基因表达的蛋白可干扰细胞周期、凋亡和染色体的稳定，

高危型HPV分型检测、HPV E6/E7mRNA检测及DNA倍体分析在宫颈HSIL+病变筛查中的应用价值

目的探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)分型检测、HPV E6/E7mRNA检测和DNA倍体分析在宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)+病变筛查中的临床价值,制定最合理的宫颈癌筛查方案。方法收集2017年6月1日至2018年12月30日于滨州医学院附属医院行三项宫颈癌筛查并有宫颈组织活检病理结果的516例患者的临床资料。根据病理结果分为宫颈HSIL+组(HSIL及宫颈癌)和宫颈低级别鳞状上皮内病变(LSIL)-组(炎症及LSIL),比较三种方法筛查宫颈HSIL+病变的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数、准确率及ROC曲线下面积,评价三种宫颈癌筛查方法在诊断宫颈HSIL+病变的临床价值。结果单独使用三种方法筛查宫颈HSIL+病变时,HR-HPV分型检测的灵敏度(94.2%)及阴性预测值(96.3%)最高,而DNA倍体分析的特异度(77.2%)、阳性预测值(48.6%)、约登指数(0.474)以及准确度(75.5%)最高,综合评价以HPV E6/E7mRNA的筛查效能最高(ROC-AUC=0.819)。联合筛查中以三种方法联合筛查的ROC曲线下面积最大(ROC-AUC=0.853)。结论三种筛查方法在筛查宫颈HSIL+病变时均有意义,三者联合筛查诊断价值最高,有效提高了宫颈高级别及以上病变的诊断率。