重组人乳铁蛋白通过促进成骨细胞增殖加速大鼠骨折愈合

目的研究重组人乳铁蛋白(rhLF)对模型大鼠股骨骨折愈合及大鼠原代成骨细胞增殖的影响。方法将雄性大鼠随机分为3组:单纯骨折组(SF组)、胶原膜处理组(CF组)和rhLF复合胶原膜处理组(CLF组)。通过X线胶片及HE和Masson染色组织学观察比较骨折愈合情况。培养的24 h新生SD大鼠原代成骨细胞以不同浓度rhLF进行处理,MTT法检测成骨细胞增殖。结果CLF组在术后1、2、3周时骨痂较SF组及CF组体积增加更明显(P<0.05),4周时组间对比差异无统计学意义。CLF组软骨痂和硬骨痂增殖更明显,并率先出现成熟骨小梁和板层骨,骨痂成熟度高。与对照组比较,第1天100 mg/L和500 mg/L rhLF组对体外培养的大鼠原代成骨细胞,吸光度(A)值有明显降低(P<0.05)。第5天及第10天时随rhLF浓度增加,A值明显升高(P<0.05)。结论在体内rhLF具有加速骨折愈合作用,表现为骨痂形成快、体积大、成熟度高。它也可以促进体外培养的成骨细胞增殖,主要表现在成骨细胞快速增殖阶段。

人乳蛋白制剂辅助治疗新生儿感染性肺炎

本文观察了由人初乳中提取的蛋白成份对新生儿肺炎的辅助治疗作用，130例新生儿肺炎患儿随机分为母乳组和强化母乳组、人工乳组和强化人工乳级，强化组给予人乳蛋白制剂。四组患儿体重增长分别为43．9±15．8克／天和47．4±14．9克／天（P＞0．05），14．7±19．7克／天和21．8±17．5克／天（P＞0．05）。临床症状减轻时间为4．8±1．9天和3．9±1．6天（P＜0．05），4．3±2．1天和4．1±1．9天（P＞0．05）。强化组在X线表现和血清免疫球蛋白方面也优于非强化组。结果提示人乳蛋白制剂对新生儿感染性肺炎有一定的辅助治疗作用。

人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究

通过PCR法直接克隆了 2 .36 6kb的人乳铁蛋白基因cDNA序列及 80 0bp的山羊 β.M乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,并连接到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA的重组质粒pLNCXHLF ,并导入到小鼠乳腺癌细胞株MA.M 782中 ,G418及PCR筛选获得阳性单克隆细胞 ,增殖后 ,转染细胞利用海藻酸钠固定化包埋培养 ,经激素诱导 ,培养液上清通过Western印记检测证明 ,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白 ,分子质量为34kDa;ELISA法测出 ,每升培养基 (含 10 5个细胞 )重组蛋白最高表达量为 6 5mg ;抗菌实验表明 ,所获得的重组人乳铁蛋白具有抑制大肠杆菌生长的作用 ,而且比人乳铁蛋白标准品作用更强。

毕赤酵母高效表达人乳铁蛋白的研究

将人乳铁蛋白全长基因克隆至酵母表达载体pPIC9K中,并建立hLF/pPIC9K/SMD1168酵母表达系统,在细胞高密度发酵条件下,乳铁蛋白表达量约1000mg/L,并具有天然蛋白相似的糖基化结构。本研究为商业化生产人乳铁蛋白提供了理论依据。

人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证

构件pbCNCS/LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明:小鼠受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂,整合率12.5%)。构件产生的3只母鼠和4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白(hLF)用ELISA方法检测,表达量分别为3.8、2.8、0.9mg.mL-1,4号后代3只母鼠表达量分别为4.2、3.9、3.6mg.mL-1。构件pAPLM片段转染细胞后,经G418筛选,挑取单克隆扩大培养,其中8株PCR阳性克隆细胞荧光显微镜观察100%都有GFP的表达。以上结果证实,双启动子能调控外源基因在乳腺中特异高水平表达hLF,双标记基因可提高筛选阳性供核细胞的准确性,这为进一步作体细胞转基因克隆奠定基础。

较长期喂养转人乳铁蛋白全乳粉对SD大鼠血清铁、铁蛋白含量的影响

目的:饲喂SD大鼠转人乳铁蛋白全乳粉90d,监测其对大鼠营养状况以及生理、血液生化指标的影响,从而评价转人乳铁蛋白全乳粉在较长期喂养实验动物时对其血清铁、血清铁蛋白含量的影响。方法:参考中华人民共和国农业行业标准《转基因植物及其产品食用安全检测——大鼠90天喂养实验》(NY/T1102—2006)进行。将140只SD大鼠按体质量随机分为7组,每组20只,雌雄各半,分别为:常规饲料对照组,转基因奶粉低、中、高剂量组和非转基因奶粉低、中、高剂量组。90d后,观察各组实验动物体质量、食物利用率以及血生化指标。结果:转人乳铁蛋白全乳粉经过90d喂养实验动物后,各组动物生长发育良好,含转人乳铁蛋白全乳粉与不含转人乳铁蛋白全乳粉组相比,大鼠的体质量与食物利用率、总进食量均无显著差异(P≥0.05),在较长期喂养过程中未观察到含转人乳铁蛋白全乳粉对大鼠产生不良作用,含转人乳铁蛋白全乳粉可显著增加血清铁和铁蛋白水平(P≤0.05)。结论:SD大鼠较长期食用转人乳铁蛋白全乳粉未出现安全问题,且可以提高实验动物机体铁的营养状况。

SDS-PAGE-薄层扫描联用法测定3种不同来源的乳铁蛋白

目的:建立快速、简便测定鲜牛奶、转基因牛奶和人乳中乳铁蛋白的方法。方法:在对样品脱脂和去除酪蛋白时,水洗乳脂、酪蛋白以提高乳铁蛋白的回收率。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离乳清蛋白,薄层扫描法定量。对电泳和薄层扫描的条件进行优化,电泳使用1.0mm×10齿的试样格、分离胶质量浓度12g/mL、分离电压100V、上样量5μL、染色3h、脱色2h;薄层扫描采取锯齿、双波长、透射的扫描方式,Y步长和摆幅宽分别为0.1mm和8mm。结果:可以分离不同来源乳中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白;乳铁蛋白加标回收率分别为104.53%、108.37%,同板精密度RSD值为3.1003%和1.8151%,在100～2000μg/mL范围内呈线性关系,相关系数为0.9988和0.9990。结论:此方法可以用于3种乳中乳铁蛋白的测定。

利用转基因牛生产重组人乳铁蛋白研究

[目的]研究利用转基因牛生产重组人乳铁蛋白,为利用转基因动物生产药用或食用蛋白提供依据。[方法]对已获得的人乳铁蛋白转基因牛进行人工催乳,用乳成分分析仪分析了转基因对乳汁的影响,并利用放免法检测了重组人乳铁蛋白在转基因牛乳中的表达。[结果]重组人乳铁蛋白在牛乳中获得了高效表达,表达水平为(3.429±0.417)mg/ml。通过转基因牛乳的乳成分分析发现,转基因牛乳与常乳在乳脂、总蛋白、乳糖和干物质的含量上没有明显变化。[结论]重组人乳铁蛋白在转基因牛乳中获得了高效表达,为大规模生产重组人乳铁蛋白奠定了基础。

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究

[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞（GFF）和乳腺上皮细胞（GMGE）移植到MII期去核卵母细胞内，经电融合、激活、体外培养后，2-8细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内，囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近（输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%）；在GFF，输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近（分别为26.47%及25.00%），输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显著高于5.93组和9.64组（40.00%及26.67%，21.43%）。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大，但对于输卵管移植，受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外，该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418及PCR筛选获得阳性细胞;转染细胞增殖后经激素诱导,培养液上清通过Western blot检测证明,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白,其分子质量为58 ku。

酪蛋白和巨细胞病毒复合启动子激活人乳铁蛋白cDNA基因在转基因小鼠乳腺中的表达

为了提高转基因动物乳腺特异性表达水平，构建了两种不同启动子的乳腺特异性表达载体，以比较其乳腺特异性表达效果。应用山羊β-酪蛋白或牛αs1-酪蛋白调控序列、鸡β-球蛋白隔离元件、巨细胞病毒（CMV）基因表达调控元件构建了乳腺特异性表达复合启动／增强子（Pcmv），以单一的酪蛋白启动子作为对照，与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体，并制备了转基因小鼠。经ELISA检测，复合启动／增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白（rhLF）表达水平（2．0～8．1g·L^-1）明显高于单一酪蛋白启动子构件（0—12mg·L^-1），而在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测到rhLF。结果提示：酪蛋白-Pcmv复合启动／增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平，而且具有良好的乳腺表达特异性。

重组人乳铁蛋白对口腔癌细胞周期及周期因子表达影响的实验研究

目的:探讨重组人乳铁蛋白(Recombinate human lactoferrin,rhLF)对口腔癌Tca8113细胞周期及周期调控因子cyclin D1、p19和p27基因表达的影响。方法:分别采用流式细胞仪和RT-PCR方法分析细胞周期及周期调控因子cyclin D1,p19和p27的mRNA水平。结果:50μg/mL、100μg/mLrhLF作用Tca8113细胞后,细胞增殖减慢,G0/G1期细胞明显增多,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);Tca8113细胞的cyclin D1 mRNA表达下降显著,50μg/mL和25μg/mLrhLF实验组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);p19和p27m RNA表达水平的变化不明显。结论:rhLF通过下调口腔癌细胞周期蛋白cyclinD1的表达来调控周期阻滞,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础。

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。

人乳铁蛋白基因转化胡萝卜研究初报

乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒感染和促进 Fe吸收等多种功能 .把人乳铁蛋白基因转入胡萝卜 ,为其添加新的营养保健因子 ,同时增强植株抗性 ,具有重要意义 .本试验把人乳铁蛋白基因插入 p BIN1 2 1质粒 Xba 、Sac 位点之间 ,经农杆菌介导 ,转入胡萝卜受体 ,在抗性筛选培养基上诱导形成抗性愈伤组织 ,进而经胚状体途径得到抗性苗 .经 PCR检测 。

人乳铁蛋白基因转化银耳的研究

利用电穿孔转化法,把携带人乳铁蛋白基因(hlf)的银耳表达载体pCB-hlf导入银耳芽孢菌株Tr21,用PCR鉴定该基因阳性转化子,检测转基因菌株的GUS活性,并用Southern杂交检测hlf的插入位点。结果表明:电穿孔转化法的转化率可达到9.25×106个/μg质粒DNA;抗性筛选的阳性转基因菌株中均能扩增出与预期大小相符的hlf、GUS和Tnos序列,且GUS基因在转基因菌株中均有表达。Southern杂交结果表明,不同转基因菌株hlf的插入位点不同,有些菌株插入了2个或更多的拷贝。RT-PCR结果表明,外源基因在银耳中能正常转录成RNA。

重组人乳铁蛋白的遗传毒性研究

目的:评价重组人乳铁蛋白的遗传毒性。方法:以重组人乳铁蛋白为受试物,按每皿62、185、556、1667、5000μg5个剂量进行Ames试验,按1.88、3.75和7.50g/kg进行小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验和精子畸形试验,并设立对照组。结果:重组人乳铁蛋白各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数的2倍,亦无剂量-反应关系;各剂量组PCE百分比均未少于阴性对照组的20%,微核发生率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);各剂量组小鼠精子畸形发生率均显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论:在本实验条件下,重组人乳铁蛋白未见遗传毒性。

转基因动物产品—人乳铁蛋白与测定方法

乳铁蛋白是一种分子量为７６．３８６ ｋＤａ的结合性糖蛋 白 ，在其多肽链上有两条碳水化合物侧链。乳铁蛋白存在于人乳及牛乳中，乳腺为主要分泌器 官。乳铁蛋白具有多种重要的生理 功能。在多种免疫细胞表面存在乳铁蛋白受体。编码人乳铁蛋白的基因全长２．３５８ ｋｂ，由 其 翻译的最初乳铁蛋白为７１１个氨基酸残基，成熟乳铁蛋白为６９２个氨基酸残基。人乳铁蛋白的 转基因研究已获成功，获得表达，并初步应用于临床治疗。乳铁蛋白的检测方法包括酶联免 疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），放射免疫（ＲＩＡ）、免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ）及免疫组化方法。还可应 用ＰＣＲ和核酸探针技术对人乳铁蛋白转基因肉品进行检测。

利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白

应用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有生产方式简单 ,产量大 ,蛋白能进行翻译后修饰等特点 ,是具有广泛前景的生物医药产业。本文就动物乳腺生物反应器的建立、检测。

荧光、紫外和红外光谱分析人乳和牛乳β-酪蛋白的功能和构象差异

β-酪蛋白是人乳酪蛋白的主要成分,但它在牛乳中的含量却很小。β-酪蛋白在两者中含量的差异,是人乳比牛乳更易消化的原因之一,研究人乳与牛乳β-酪蛋白结构和功能的差异,对研制出更适合婴儿肠道的,新型人乳模拟型婴儿配方奶粉具有指导性的意义。用紫外分光光度法研究人乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白的溶解性、巯基含量、乳化性等功能性质,用荧光光谱和红外光谱分析比较两种蛋白的结构特点。两种蛋白等电点十分接近（pH 4.0~5.0）,在等电点附近时,人乳β-酪蛋白的溶解性（10.83%）低于牛乳β-酪蛋白（11.83%）,而偏离等电点时人乳β-酪蛋白具有更高的溶解性,人乳β-酪蛋白的乳化活性指数（110~140m^2·g^-1）高于牛乳β-酪蛋白（70~130m^2·g^-1）,两种蛋白的表面巯基（SH）相似[（18.47±0.08）和（18.67±0.17）μmol·g^-1],而牛乳β-酪蛋白总巯基的含量[（47.46±0.23）μmol·g^-1]大于人乳β-酪蛋白[（26.17±0.12）μmol·g^-1],两种蛋白官能团相似,均含有β-折叠结构,人乳β-酪蛋白的氢键数量和内部的疏水性均小于牛乳β-酪蛋白。结果表明,人乳β-酪蛋白比牛乳β-酪蛋白具有更少的α-螺旋和β-折叠等二级结构,具有更疏松灵活的三级结构,同时也具有更高的分子的表面活性。

人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

为了研究人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用及其对细胞凋亡、p53蛋白表达和Caspase-3活性的影响,试验采用MTT方法检测细胞的生长抑制率、DNA片段化试验检测细胞凋亡、流式细胞术测定细胞周期、Western-blot检测p53蛋白表达、Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性。结果表明:人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的抑制呈现时间和剂量依赖性,有73%的Hela细胞停滞在G0G1期;Western-blot检测结果显示人乳铁蛋白可以上调p53蛋白的表达;人乳铁蛋白作用48 h后Caspase-3的活性是0小时时的5.5倍,二者差异极显著(P<0.01)。结果说明人乳铁蛋白能显著抑制宫颈癌Hela细胞生长,其抗肿瘤机制与诱导细胞凋亡、调控细胞周期、上调p53表达、活化Caspase-3有关。