体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究

[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞（GFF）和乳腺上皮细胞（GMGE）移植到MII期去核卵母细胞内，经电融合、激活、体外培养后，2-8细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内，囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近（输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%）；在GFF，输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近（分别为26.47%及25.00%），输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显著高于5.93组和9.64组（40.00%及26.67%，21.43%）。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大，但对于输卵管移植，受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外，该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418及PCR筛选获得阳性细胞;转染细胞增殖后经激素诱导,培养液上清通过Western blot检测证明,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白,其分子质量为58 ku。

人乳铁蛋白基因转化银耳的研究

利用电穿孔转化法,把携带人乳铁蛋白基因(hlf)的银耳表达载体pCB-hlf导入银耳芽孢菌株Tr21,用PCR鉴定该基因阳性转化子,检测转基因菌株的GUS活性,并用Southern杂交检测hlf的插入位点。结果表明:电穿孔转化法的转化率可达到9.25×106个/μg质粒DNA;抗性筛选的阳性转基因菌株中均能扩增出与预期大小相符的hlf、GUS和Tnos序列,且GUS基因在转基因菌株中均有表达。Southern杂交结果表明,不同转基因菌株hlf的插入位点不同,有些菌株插入了2个或更多的拷贝。RT-PCR结果表明,外源基因在银耳中能正常转录成RNA。

人乳腺组织中乳铁蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出长度为2259 bp的人乳铁蛋白cDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在pMD 18-T载体的T位点。测序结果和序列分析显示,与GenBank中收录的人、小鼠、奶牛和山羊的乳铁蛋白cDNA序列的同源性分别为99．73％,82．19％,81．79％和87．28％。其中与人乳铁蛋白cDNA 序列相比,发现有5个碱基因等位基因间的突变而发生变异,1个碱基发生了未知的突变,表明已成功的扩增、克隆了人乳铁蛋白基因cDNA序列,此基因序列的GenBank登录号为AY165046。

转人乳铁蛋白基因牛奶粉致突变性

目的观察转人乳铁蛋白基因牛奶粉(LF)有无致突变效应。方法将40只雄性昆明小鼠随机分为8组,以2 500、5 000、10 000 mg/kg的转人乳铁蛋白基因牛奶粉(LF)连续灌胃5 d,以同等剂量的普通奶粉(荷斯坦奶牛)为亲本对照,并设阴性对照组和阳性对照组。于小鼠首次染毒后第35天观察精子畸形率。将80只昆明种小鼠按上述剂量及分组方法分为8组。间隔24 h两次给小鼠经口灌胃,观察骨髓嗜多染红细胞微核率。采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株,LF设0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/皿5个剂量,以同等剂量的普通奶粉(荷斯坦奶牛)为亲本对照,并设阴性对照组和阳性对照组,采取非代谢活化和代谢活化(加S9)两种方式进行Ames试验。结果转人乳铁蛋白基因牛奶粉(LF)小鼠精子畸形试验、小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验结果均为阴性。结论在本试验条件下未见转人乳铁蛋白基因牛奶粉(LF)有致突变效应。

人乳铁蛋白cDNA基因的克隆

目的:克隆人乳铁蛋白c DNA基因,进而为重组人乳铁蛋白的制备奠定基础。方法:从人静脉血中性粒细胞中提取得总RNA,RT-PCR法扩增人乳铁蛋白c DNA基因后,将其插入到克隆载体p JET1.2,DNA测序法鉴定基因序列。结果:从人静脉血中性粒细胞中分离获得了总RNA,RT-PCR法克隆了人乳铁蛋白c DNA基因,经过DNA测序分析鉴定,其结果与Gene Bank中序列完全一致。结论:成功从人静脉血中性粒细胞中克隆扩增了人乳铁蛋白c DNA基因,为重组人乳铁蛋白的制备奠定基础。

同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊β-乳球蛋白位点效率的影响

【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因(hLF)打靶山羊β-乳球蛋白基因(BLG)座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG-/hLF+基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度(6.0、3.5和1.2 kb)的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500μg/mLG418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体(BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3),对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG-/hLF+基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%(42/83)、49.4%(38/77)和51.2%(44/86)。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异(P>0.05),表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF+/BLG-基因打靶细胞株(BLG基因座定点打靶hLF基因),但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。

导入人乳基因的克隆牛在芦台降生

今年1月14日，一对毛色光亮的双胞胎克隆牛犊在河北省新华奶牛场降生。由于牛犊体内导入了人乳铁蛋白基因，两头牛犊长大后，所产牛奶将含有人乳成分，具有极高的营养价值。同时，这两头牛犊的降生，也标志着我国转基因克隆奶牛技术取得重大进展。

精子介导转基因动物的制备

采用直接注射的方法,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因的重组质粒pLNCXHLF注入兔睾丸组织和羊输精管中,一个月后分别与正常雌兔及正常的母羊交配。所产仔兔均为活体,经PCR和Southern检测,转基因仔兔阳性率平均为35%(11/31);羔羊经引物F1/R1系统PCR检测阳性率为33.3%(4/12),F2/R2系统PCR检测阳性率为25%(3/12)。将流产羔羊组织解剖后提取舌、肺、肝脏、肌肉、皮肤、脑、生殖腺、脾脏、小肠、心脏、肾脏共11种组织的总DNA进行PCR检测,发现:F1/R1和F2/R2系统PCR检测出阳性信号存在于不同组织;F2/R2PCR系统检测阳性信号较F1/R1PCR系统少;而且各种组织的外源DNA存在的拷贝数不等,造成阳性信号的强弱程度不同。结果表明:1)脂质体包裹外源基因转染精子的方法,可将外源基因导入受精卵,并得到了较高的转基因阳性率;2)精子携带外源DNA的整合过程是随机的,在受精过程和胚胎早期分化过程中可能发生了片段丢失、不完全整合或游离于基因组存在而产生嵌合体。本文的研究结果证明了该方法是一种简捷有效的新途径,为进一步深入探讨精子介导转基因动物制备可行性奠定了基础,给精子载体法制备转基因哺乳动物研究提供了有价值的参考。

人乳铁蛋白转基因山羊奶与非转基因羊奶中3种水溶性维生素含量的检测分析

目的测定人乳铁蛋白转基因羊奶及非转基因羊奶中VB1、VB2及尼克酰胺的含量,考察其在2种羊奶中是否存在显著差异。方法 HPLC法测定泌乳30 d、60 d及90 d采集的2种羊奶中各90个样品的上述3种维生素含量,并进行统计学分析。结果泌乳30 d、60 d及90 d采集转基因羊奶,VB1含量分别为0.151μg/ml、0.102μg/ml、0.068μg/ml,VB2含量分别为1.622μg/ml、0.784μg/ml、1.228μg/ml,尼克酰胺含量分别为23.28μg/ml、8.032μg/ml、5.346μg/ml。结论 60 d及90 d,转基因羊奶与非转基因羊奶的VB1含量存在显著差异,30 d及60 d,2种羊奶的VB2含量存在显著差异。在3个时间段采集的样品中,2种羊奶的尼克酰胺含量均差异具有统计学意义(P≤0.05)。

我国浙江大学科学家发明控制转基因水稻“逃逸”的转基因技术

据2008年4月4日《新民晚报》消息，日前，浙江大学农学院沈志成教授领衔的课题组发明了一种转基因技术，解决了进行田间试验的转基因水稻“逃逸”难题。他们在进行水稻转基因操作时，在向水稻基因组转入抗虫、纤维素酶或人乳铁蛋白基因的同时，利用RNA干扰技术抑制了水稻本身具有的对除草剂苯达松的“解毒酶”，

根癌农杆菌转化甘薯高频获得抗性愈伤组织的研究

作者用根癌农杆菌LBA4 4 0 4转化甘薯 8个品系 (该农杆菌携带有含人乳铁蛋白基因 (hLFc)的表达质粒 pCSL2 34) ,研究了转化甘薯的频率 .结果转化有效叶片 2 4 9片 ,共获得 6 5个抗性愈伤组织 ,平均转化频率为 2 6 .10 %,有 14.4 6 %的叶片发生了转化 .不同品种的转化频率有很大的差异 ,从 0～ 6 9.35 %,表明转化频率受基因型的影响很大 ,94 0 3 4是一个重要的高转化频率甘薯品系 .该研究中采用的完整叶片转化方法是一种较好的改良叶盘转化法 .

我成功克隆双胞胎奶牛

2005年1月14日，一对毛色光亮的双胞胎克隆牛犊在河北省唐山市芦台经济技术开发区新花奶牛场降生。由于其体内导入了人乳铁蛋白转基因，这两头牛犊长大后，所产牛奶将含有人奶的成分，具有极高的营养价值。这两头牛犊的降生标志着我国转基因克隆奶牛生产又取得重大进展。