枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻2BS融合细胞DNA合成的影响

目的 :研究枸杞子、淫羊藿水提液对衰老 -年轻 2BS融合细胞DNA合成的影响。方法 :以人胚肺二倍体成纤维细胞国内标准株 2BS为衰老模型 ,用细胞脱核和细胞融合技术 ,观察枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻 2BS融合细胞的DNA合成的影响。结果 :2BS细胞分别在含 0 0 2 5 (V/V)枸杞子、淫羊藿水提液的DMEM培养液中 ,可连续培养至 6 1 0± 2 9、5 6 0± 2 6代 ,对照组为 4 9 0± 2 6代 (P <0 0 1) ;衰老的 2BS细胞分别用枸杞子、淫羊藿水提液处理 2h后 ,进行细胞脱核并与年轻 2BS细胞融合 ,其〔3H〕TdR掺入百分率明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论 :枸杞子、淫羊藿均能促进衰老 -年轻 2BS融合细胞的DNA的合成速率 ,延长 2BS细胞寿命。

年轻与衰老2BS细胞中差异表达基因片段的筛选及特征分析

为探索人衰老机制 ,采用差异显示法分别从年轻和衰老 2BS细胞中筛选出特异的cDNA片段 .衰老相关细胞cDNA片段长 2 86bp ,命名为orc ,GenBank登录号为AI35 30 6 5 ;年轻相关的cDNA片段长 2 35bp ,命名为yrc ,GenBank登录号为AI35 30 6 4.Southernblot分析表明 ,yrc在衰老和年轻2BS细胞、BGC 82 3细胞中的BamHⅠ酶切图谱均出现约 3 0kb杂交带 .Northern印迹分析显示 ,yrc在年轻和衰老 2BS细胞中均有 1 0kb和 0 5kb杂交带 ,其中 1 0kb带在两种细胞间差异不大 ,而0 5kb带则在年轻细胞中明显高于衰老细胞 .在胎儿心、肺、肝中也可见 0 5kb和 1 0kb两条杂交带 ;而在胎盘及胎儿肌肉、肾、脑、皮肤中 ,则只可见 0 5kb杂交带 ,无 1 0kb带 .orc基因转录本长约 2 0kb ,在衰老 2BS细胞中的表达高于年轻细胞 .结果表明 ,orc和yrc分别与细胞衰老和年轻相关 ,yrc 0

慢性纤维空洞型肺结核病人血清促2BS细胞增生的研究

实验采用一组慢性纤维空洞型肺结核（简称慢纤洞肺结核）病人血清，观察了其对２ＢＳ细胞促增生的影响。结果证明，加病人血清２ＢＳ细胞培养组的ｃｐｍ值明显高于对照组，而且随着血清浓度的升高，ｃｐｍ值亦增高，增殖量从１．７４到９．９９倍。提示了慢纤洞肺结核病人血清中含有多种细胞因子，或以纤维化的形式痊愈，或以纤维化导致气体交换面积减少，最后导致呼吸功能衰竭。

化纤方对人胚肺二倍体纤维母细胞的增殖抑制作用

目的:探讨中药化纤方对人胚肺二倍体纤维母细胞(2BS)增殖的抑制作用及其机理,为中医药介入肺纤维化防治提供实验和理论支持。方法:采用中药血清药理学实验方法,观察化纤方含药血清对2BS细胞的细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:经化纤方含药血清作用后,2BS细胞增殖受到显著抑制,并出现明显的细胞凋亡现象;化纤方各组S期细胞数显著增加,而G2/M期细胞数则明显下降,提示该方药可阻抑S期细胞向G2/M期的移行,从而抑制其分裂增殖。结论:化纤方有明显的抗肺纤维化作用,其作用机制可能是阻抑细胞增殖周期并诱导其发生细胞凋亡。

灵芝多糖抗H_2O_2诱导的HDF细胞衰老及其机制的研究

目的探讨不同剂量灵芝多糖(GLP)对抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及可能的细胞周期调控机制。方法将HDF细胞培养至24代时分成6组:即青年组、对照组、衰老模型组及GLP小剂量(50mg/L)、中剂量(100mg/L)、大剂量(150mg/L)组,体外DMEM培养,各GLP组和衰老模型组自30代始添加H2O2诱导HDF细胞衰老,直至38代。采用MTT法检测细胞活力;Dimri法检测β-半乳糖苷酶活性;RT-PCR法检测p16INK4a、CyclinD1、CDK4的表达;Western印迹法检测Rb蛋白表达和磷酸化Rb。结果与青年组及对照组比较,衰老模型组细胞活力下降(P<0.01),β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.01),CyclinD1 mRNA表达升高(P<0.01),CDK4 mRNA表达下降(P<0.01),p16INK4a表达升高(P<0.01),Rb磷酸化减少(P<0.01);与衰老模型组细胞比较,中剂量和大剂量GLP细胞活力明显提高(均P<0.01),而β-半乳糖苷酶活性降低(均P<0.01),CyclinD1 mRNA表达降低(均P<0.01),CDK4 mRNA表达升高(均P<0.01),p16INK4a表达降低,Rb磷酸化增多(均P<0.01),但两组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论GLP可通过改变细胞周期调控因子CyclinD1/CDK4/p16INK4a进而调节Rb的磷酸化状态,发挥抗H2O2诱导的HDF细胞衰老作用。

雌核发育二倍体鲫鲤及其他倍性鱼cdc2基因cDNA全序列克隆及表达

为研究雌核发育二倍体鲫鲤产生二倍体卵子的分子机制,实验采用PCR和cDNA末端快速分离法,克隆获得了雌核发育二倍体鲫鲤第三代(G3)、二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的细胞周期相关基因——cdc2基因cDNA全序列。结果显示,4种不同倍性鱼cdc2基因均编码含有302个氨基酸蛋白,而且编码的蛋白都含有与其他CDK激酶相当保守的序列PSTAVRE;同源性分析发现,4种鱼cdc2基因编码的氨基酸序列之间的相似度大于97.6%,说明Cdc2蛋白在这4种不同倍性鱼中具有高度保守性。采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)对cdc2基因在G3、二倍体红鲫、三倍体湘云鲫及四倍体鲫鲤早期卵巢中的表达进行分析,结果发现,G3cdc2基因比普通二倍体红鲫和三倍体湘云鲫表达要高,比四倍体鲫鲤的表达水平低。该研究从分子水平证明了G3早期性腺中存在着大量的多倍体卵原细胞。同时,研究表明,cdc2基因在雌核发育二倍体鲫鲤早期卵巢的高表达暗示着G3多次进入S期却不经历M期导致二倍体配子的产生。

腺病毒介导的HCY2基因对血管平滑肌细胞凋亡的诱导作用

目的 观察高同型半胱氨酸诱导基因HCY2对于平滑肌细胞的作用。方法 以复制缺陷型腺病毒作为载体 ,将HCY2基因转移到平滑肌细胞中。提取平滑肌细胞的DNA ,进行凝胶电泳及ELISA ,行DNA片段化分析。用流式细胞术观察平滑肌细胞的亚二倍体。结果 转染HCY2后平滑肌细胞的DNA断裂成相差 2 0 0bp左右的片段 ,流式细胞术测定时发现 ,位于亚二倍体区的平滑肌细胞明显增多。结论 HCY2基因能引起平滑肌细胞的凋亡。

比较胰酶/EDTA两种消化液对携带水痘-带疱疹病毒的2BS消化效果分析

目的比较胰酶和EDTA两种消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞冻融后的病毒滴度(VT)。方法分别配制两种浓度的胰酶和EDTA:0.125%、0.25%的胰酶,0.01%、0.02%的EDTA各1000ml,按比例加入预先培养好的携带水痘-带疱疹病毒的等量2BS细胞中,消化后,用显微镜观察细胞形态,消化液离心、浓缩、冻融、检测并比较病毒滴度。结果与0.125%、0.25%的胰酶、0.01%EDTA,0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合消化液相比,用0.02%的EDTA消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞,冻融后的病毒滴度提高了1.3～0.8个log值。结论用0.2%EDTA消化液消化的含有水痘病毒的细胞获得的病毒滴度最好。

人二倍体细胞(2BS株)细胞库的建立及生物学特性鉴定

目的建立人二倍体细胞（2BS株）主细胞库和工作细胞库。方法将人二倍体细胞（2BS株）扩大培养后冻存,建立主细胞库和工作细胞库,采用台盼蓝染色计数细胞,计算细胞活力,并进行染色体、外源病毒因子、微生物污染、致瘤性的检测及鉴别试验。将全面检定合格的工作细胞库细胞分别接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂,观察细胞形态;将水痘病毒分别按0.010 5、0.012 8、0.018 8 MOI接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂上的单层细胞,收获病毒原液,检测病毒滴度。结果主细胞库细胞活力为94.1%,工作细胞库细胞活力为94.4%;1 000个处于分裂相时期的细胞的核型分析结果均在《中国药典》三部（2010版）人二倍体细胞染色体分析标准的规定范围内;细胞上清液和裂解液中人外源病毒因子检测结果均为阴性,符合《中国药典》三部（2010版）规程要求;细胞均贴壁,成纤维细胞形态,种属鉴别为人细胞B型;细胞库未被细菌、真菌、病毒及支原体污染,也未出现致瘤性。建立的细胞库在3种培养器皿中均可在工艺要求时间内生长为单层,单位面积活细胞浓度在（2.01~2.59）×105个/cm2之间,收获的病毒滴度在5.0~5.25 lg PFU/ml之间,符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。结论建立了人二倍体细胞（2BS株）主细胞库和工作细胞库,为2BS细胞应用于水痘减毒活疫苗的研发和生产提供细胞资源和理论依据。

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .

中药山桔颗粒抑制人巨细胞病毒感染的体外实验研究

本研究借助体外细胞培养技术观察不同浓度的山桔颗粒药物在2BS细胞培养内对人巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用,实验采用细胞病变效应(CPE)法,计算山桔颗粒药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI),半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0),结果表明山桔颗粒在体外能够有效地抑制HCMV导致的细胞病变,具有抗HCMV作用。

疫苗生产用人二倍体细胞2BS和MRC-5中猪圆环病毒的检测

目的检测疫苗生产用人二倍体细胞2BS和MRC-5是否存在外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)污染。方法对已建立的PCR方法进行灵敏度验证后,检测人二倍体细胞2BS和MRC-5中PCV1和PCV2污染情况。结果两种细胞上清中最低均可检出1 pg的PCV1和PCV2 DNA,灵敏度较高;两种细胞中PCV检测结果均为阴性。结论在生产用人二倍体细胞2BS和MRC5中,均未检出PCV1和PCV2污染。

低剂量照射对细胞周期和修复基因表达的影响

目的观察低剂量照射对A549(肺癌细胞)和2BS细胞(人胚胎肺成纤维细胞)细胞周期及修复基因表达的影响。探讨肿瘤细胞与正常细胞在诱导修复基因表达方面的差异,并结合细胞周期变化,进一步阐明适应性反应形成机制。方法(1)应用流式细胞技术,对不同剂量照射后A549和2BS细胞周期进行分析;(2)应用Northem-blot检测不同照射剂量DNA修复基因hR24L、hRAD6和hRAD52转录水平的变化。结果(1)2BS细胞经75mGyX线照射组,及低剂量加高剂量照射组于照后30分钟即出现明显的G2期阻滞,且细胞周期于24小时内恢复。A549细胞在75mGyX线照射后,细胞周期未发生变化;(2)2BS细胞在75mGyX照射下,b.R24L、hRAD6表达增强,hRAD52无变化。A549细胞低剂量照射修复基因表达未见显著变化。结论低剂量照射后2BS细胞与A549细胞周期改变存在差异,且细胞周期的调控与DNA修复基因的表达有着密切的关系。

体外受精-胚胎移植中颗粒细胞凋亡与妊娠率

目的探讨体外受精-胚胎移植中卵泡颗粒细胞凋亡与妊娠率的关系。方法随机选择体外受精-胚胎移植中60例患者,收集其颗粒细胞,采用流式细胞技术检测颗粒细胞亚二倍体的含量和PDCD5的荧光密度;颗粒细胞免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、PDCD5的表达。比较妊娠组和非妊娠组年龄、基础FSH值、促性腺激素的用量、取卵总数、受精率、妊娠率和颗粒细胞亚二倍体细胞的百分率、颗粒细胞PDCD5荧光密度、颗粒细胞Bcl-2、Bax、PDCD5蛋白表达的积分光密度值。结果妊娠组和非妊娠组年龄、基础FSH值、促超排卵FSH的用量、取卵数、受精率及免疫组化Bax积分光密度比较,差异无显著性(P>0.05),颗粒细胞亚二倍体百分率、颗粒细胞PDCD5荧光密度、PDCD5蛋白表达的积分光密度值妊娠组低于非妊娠组,颗粒细胞Bcl-2表达的积分光密值妊娠组高于非妊娠组,差异有显著性(P<0.05)。结论体外受精-胚胎移植中卵泡中颗粒细胞凋亡与妊娠率有关,凋亡率高,妊娠率低。

衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3的表达

目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP-3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP-3上游包括5′-UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP-3启动子片段;将各片段用Effectene Transfection Reagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因的表达升高;在IG-FBP-3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5′-ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc-3′是IGFBP-3的增强子元件。结论:在衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件IEE(IGFBP-3enhancerelement),对IGFBP-3的表达起到调控作用。

对年轻细胞诱导早衰前后凋亡敏感性的研究

目的 探讨年轻细胞被诱导衰老后对凋亡的敏感性与年轻细胞的差异 ,并分析可能存在的机制。方法 以人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)为研究对象 ,以H2 O2 诱导 2BS细胞早衰后 ,再以H2 O2 分别诱导早衰 2BS细胞和年轻细胞凋亡 ,DNAladder分析和苔盼蓝排除法检测细胞死亡率。结果 早衰细胞较年轻细胞不易被H2 O2 诱导凋亡。该因素是多方面的 ,不限于caspase - 3的作用。 结论 早衰细胞与衰老细胞一样 。

半乳糖受体介导的c-myc反义核酸联合三氧化二砷对人肝癌细胞的增殖抑制作用

目的 探讨Gal-PEI-c -mycASODN与三氧化二砷 (As2 O3 )联合应用对人肝癌Bel- 74 0 2细胞增殖的影响。方法 As2 O3 分别或联合Gal-PEI-c -mycASODN与人肝癌Bel- 74 0 2细胞共孵育 4 8h ,台盼蓝染色法检测细胞增殖的变化 ,流式细胞仪分析细胞亚二倍体百分率。结果 0 5 μmol/LAs2 O3 和Gal-PEI-ASODN(含A SODN 0 12 5 μmol/L)均不能抑制Bel- 74 0 2细胞增殖 ,0 5 μmol/L的As2 O3 联合Gal-PEI-ASODN(含ASODN 0 12 5μmol/L)对Bel- 74 0 2细胞增殖有明显抑制作用 (P <0 0 5 ) ,与 4 μmol/LAs2 O3 产生的抑制作用相当 ;1 0 μmol/LAs2 O3 不引起Bel- 74 0 2细胞凋亡 ,但联合Gal-PEI-ASODN(含ASODN 0 2 5 μmol/L)即导致Bel - 74 0 2细胞凋亡。结论 Gal-PEI-ASODN联合As2 O3 能明显提高肝Bel- 74 0 2细胞对As2 O3 的敏感性 ,抑制Bel- 74 0 2细胞增殖 ,促进细胞凋亡。

新生牛血清的质量控制对SPF鸡胚细胞和人二倍体(2BS)细胞生长的影响

目的考察新生牛血清质量控制对SPF鸡胚细胞和人二倍体(2BS)细胞生长的影响。方法选择来源可追溯性、工艺质量稳定,且检定合格的新生牛血清样品配制细胞生长液,用于SPF鸡胚细胞和2BS细胞的培养。待细胞生长成致密成纤维单层细胞,记录细胞成单层的时间,用胰酶消化细胞,通过全自动细胞计数仪对细胞悬液进行测定,观察总细胞数、活细胞数,计算细胞存活率。根据活细胞数计算MOI,分别用腮腺炎及风疹病毒接种SPF鸡胚细胞和2BS细胞,检测收获病毒液的滴度。结果SPF鸡胚细胞总细胞数不低于3.5×10~6个/mL,活细胞数不低于2.1×10~6个/mL,细胞存活率不低于60%;2BS细胞总细胞数不低于7.0×10~5个/mL,活细胞数不低于4.2×10~5个/mL,细胞存活率不低于60%。腮腺炎病毒原液滴度在6.1～6.6 lgCCID_(50)/mL之间,平均值为6.28 lgCCID_(50)/mL,SD为0.11,生产过程加工能力指数(process capability index,Cpk)为1.51,批间质量趋于一致;风疹病毒原液滴度均在5.5～6.2 lgCCID_(50)/mL之间,平均值为5.8 lgCCID_(50)/mL,SD为0.17,Cpk值为1.40,批间质量趋于一致。结论新生牛血清的质量良好,用其培养SPF鸡胚细胞和2BS细胞的活细胞比率可控,收获的病毒液滴度较均一,差异性较小。

二甲双胍通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路对细胞衰老的影响

目的探讨二甲双胍(Met)通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路对细胞衰老的影响。方法选取2BS细胞分成四组,即对照(NC)组、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)组、Met组、Met+IGF-1组。加药处理后进行SA-β-Gal染色检测细胞衰老水平、CCK8试验检测细胞增殖能力、EdU试验检测DNA合成能力以及Western blot检测各组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达。结果各组SA-β-Gal染色阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Met+IGF-1组SA-β-Gal染色阳性率低于IGF-1组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。在相同时间点,Met+IGF-1组OD450值高于IGF-1组,差异有统计学意义(P<0.05)。EdU染色后在370 nm处的染色结果显示,各组OD370值比较,差异有统计学意义(P<0.05);Met+IGF-1组OD370值高于IGF-1组,差异有统计学意义(P<0.05)。Met组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量低于其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。IGF-1组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。Met+IGF-1组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量低于IGF-1组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Met可通过抑制IGF-1/PI3K/Akt信号通路来延缓细胞衰老。