热量限制延缓人二倍体成纤维细胞衰老的体外模型

为建立人二倍体成纤维细胞IMR 90的热量限制体外模型 ,分别采用低浓度、正常浓度和高浓度葡萄糖培养条件 ,常规传代培养IMR 90细胞 ,利用综合细胞衰老指标对模型进行评价 .低、正常和高浓度葡萄糖培养条件组IMR 90细胞平均寿限分别为 5 8 3、5 5 0和 4 7 2PDL(群体倍增水平 ) .低浓度葡萄糖培养IMR 90细胞早期增长速度有所减慢 ,但仍保持对生长因子诱导的细胞增殖能力 ,并使晚期IMR 90处于细胞周期S期的比例以及其DNA修复能力显著高于其他条件培养的晚期细胞 .低浓度葡萄糖培养IMR 90晚期细胞的半乳糖苷酶染色阳性率亦明显低于其他条件培养的晚期细胞 .实验结果表明 ,低浓度葡萄糖培养可以延缓IMR 90复制衰老 ,建立了热量限制延缓衰老体外模型 。

P16降低二倍体成纤维细胞的凋亡敏感性

脂质体介导法分别介导正、反义p16逆转录病毒表达载体转染人胚肺二倍体成纤维细胞 ,经鉴定后 ,分别用Hoechst33342 PI双染、TUNEL、DNAladder分析检测各转染细胞对H2 O2 的敏感性 .结果显示 ,反义p16重组体转染细胞较易凋亡 ,而正义p16重组体转染细胞不易凋亡 .Western印迹检测显示 ,正义p16重组体转染细胞中P2 1表达增强 ,caspase 3的表达减弱 .H2 O2 作用后 ,正义p16重组体转染细胞Bcl 2蛋白水平显著高于反义p16重组体转染细胞 .

人胚肺二倍体成纤维细胞端区长度的代龄变化

以体外培养的不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）为实验对象，HeLa细胞为对照，分别观察其端区长度随代龄的变化．结果显示年轻2BS细胞（24代）端区长度约9．13kb；衰老2BS细胞（64代）端区长度约7kb，丢失约2kb．2BS细胞端区长度随代龄的增长而缩短．密度扫描结果显示细胞每复制一代，端区平均丢失50bp，而HeLa细胞的端区长度未因代龄而变化．

发酵黄芪对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖及衰老相关蛋白表达的影响

目的探讨发酵黄芪对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖及衰老相关蛋白表达的影响。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),并根据代龄和加药情况分为青年组(30代前的HDF细胞),模型组(40代后的HDF细胞),对照组(用10%正常血清处理的40代后的HDF细胞),实验组(用10%发酵黄芪干预血清处理的40代后HDF细胞)。培养至40代时开始干预,光学倒置显微镜观察各组HDF细胞形态;采用活细胞计数(CCK-8)法检测各组HDF细胞增殖情况;采用分光光度法检测各组HDF细胞β-半乳糖苷酶(β-gal)活性;采用蛋白免疫印迹(Wb)法检测各组HDF细胞p16、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的蛋白表达。结果与青年组比较,模型组、对照组及实验组HDF细胞增殖能力及CDK4蛋白相对表达量均显著降低,且实验组高于模型组和对照组(P<0.05);HDF细胞β-gal活性及p16、CyclinD1蛋白相对表达量均显著升高,且实验组低于模型组和对照组(P<0.05),模型组与对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论发酵黄芪可促进HDF细胞增殖,降低β-gal活性,同时抑制衰老相关蛋白的表达,进而发挥抗细胞衰老的作用。

淫羊藿苷对人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的干预作用研究

目的观察淫羊藿苷对人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)衰老的干预作用与机制,为明确淫羊藿苷作为有效干预衰老的候选中药单体提供实验依据。方法 MRC-5进行体外培养,利用淫羊藿苷进行干预,观察细胞的传代次数;利用β-半乳糖苷酶染色观察衰老细胞阳性率;MTT法检测细胞活力;分别使用单细胞凝胶电泳和流式细胞仪检测H2O2诱导细胞DNA损伤和凋亡变化。结果淫羊藿苷能够延缓MRC-5细胞的复制性衰老,促进细胞增殖,减轻H2O2诱导的细胞DNA损伤,促进受损细胞的凋亡。结论淫羊藿苷能够延缓二倍体细胞的复制性衰老,这可能与其能够减轻细胞DNA损伤有关。

烹调油烟挥发性有机物对人胚肺二倍体成纤维细胞活性氧水平的影响

目的:研究烹调油烟挥发性有机物(COF VOCs)对人胚肺二倍体成纤维细胞(HELF)活性氧(ROS)水平的影响。方法:用活性炭采集烹调油烟挥发性有机物,对HELF进行染毒,采用MTT试验测得半数抑制浓度(IC50),设计剂量和暴露时间,设立添加和不添加维生素C组,以2',7'-二氯双氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和双氢罗丹明123(DHR123)进行标记,通过流式细胞术检测细胞ROS水平。结果:COFVOCs刺激HELF12、24、48h的IC50分别是104.9、111.9和127.2μg/mL;HELF胞质内ROS平均荧光强度随COFVOCs剂量增加而增高;线粒体内ROS24、48h暴露于0.8、4μg/mL剂量与阴性对照组相比有统计学差异;维生素C预处理后,ROS平均荧光强度较未预处理时均有所降低,100μg/mL剂量组前后差异有统计学意义。结论:COFVOCs可引起HELF内ROS水平升高,维生素C对细胞的ROS升高有一定的抑制作用。

高糖诱导人二倍体成纤维细胞衰老相关基因的表达

利用RT-PCR分子生物学技术,研究了高浓度葡萄糖对人二倍体成纤维细胞衰老相关基因表达的影响。研究结果表明,高浓度葡萄糖诱导人二倍体成纤维细胞衰老可能与p16和p21基因高表达相关,而与p53基因表达关系不密切。

红景天苷、白藜芦醇和人参提取物对中波紫外线诱导人二倍体成纤维细胞损伤的保护作用

目的:探讨红景天苷、白藜芦醇及人参提取物不同时间处理对中波紫外线UVB诱导人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)损伤的保护作用。方法:采用UVB照射2BS细胞不同时间,将5μmol/L红景天苷、10μmol/L白藜芦醇及25μg/ml人参提取物提前2小时加入细胞或者于照射后加药,培养一定时间后采用MTT法测定细胞活力。结果:红景天苷和白藜芦醇于照射前加药或者照射后加药均能有效上调UVB照射后的2BS细胞活力(P<0.05),而人参提取物提前加药能有效逆转UVB照射后2BS细胞活力的下降(P<0.05),于UVB照射后给药则无此作用(P>0.05)。结论:三者均能有效保护2BS细胞,减少UVB诱导的损伤,红景天苷和白藜芦醇对细胞照射后的损伤修复可能具有一定的促进作用。

黄芪对体外人胚肺二倍体成纤维细胞的抗衰老作用研究——Ⅱ.超微形态研究

以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞为材料,在用扫描和透射电镜观察细胞衰老过程中超微结构变化的同时,动态观察黄芪抗细胞衰老效应。结果表明,体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞成活至52代,而含0.2%黄芪制取液的培养基使细胞成活至77代。扫描电镜下可见细胞随增龄而由扁平长梭形变为圆球形,伪足、微绒毛递增,细胞胞体变小,细胞凹陷增多且逐步加深。透射电镜显示细胞增龄变化主要为细胞核逐渐变小,核进行性凹陷加深,核膜从部分融合到全部崩解;异染色质渐增,而常染色质递减;核仁变小且疏松;线粒体减少,嵴少,基质凝聚,肿胀,空泡化;粗面内质网减少,脱粒,游离核糖核蛋白体增多;高尔基复合体减少,其囊泡排列紊乱且肿胀;溶酶体递减;脂褐质递增.黄芪组细胞衰老过程中细胞器的变化与上述非黄芪组细胞的衰老变化规律基本相同;但其改变程度显然较轻,变化速率相对缓慢.特别是黄芪组细胞之高尔基复合体、中心体特别发达,虽细胞已衰老而它们却不甚衰老.研究证明黄芪具抗衰延寿的良好效应,以其做为抗衰老延寿命的药物值得高度重视和大力开发.

高浓度葡萄糖促进人二倍体成纤维细胞迅速衰老

利用光学显微镜观察和酸性 β 半乳糖苷酶染色技术研究了高浓度葡萄糖对人二倍体成纤维细胞 2BS细胞衰老进程的影响 ,并用流式细胞仪检测了此过程中活性氧和线粒体膜电位差的变化。结果表明 :2 0 0mmol L的葡萄糖对 2BS细胞有生长抑制作用 ,能引起活性氧含量的变化 ,导致线粒体膜电位差显著下降 ,并诱导了细胞的衰老。这为氧化损伤假说提供了新的证据 ,并为研究活性氧和复制衰老之间的关系提供了较好的体系。

喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的影响

目的:通过体外实验,初步研究喙尾琵琶甲乙醇提取物A、B、C对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制作用,并比较3种提取物的抑制效果。方法:用浓度为3.9～1 000.0μg/mL的A、B、C提取物作用于体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对细胞增殖的影响。结果:高浓度的3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长均有显著的抑制作用,并且呈时间-剂量-效应的依赖关系。在质量浓度为1 000.0μg/mL、72 h时,A、B、C对细胞的抑制率达到最大,分别为49.87%、50.13%、42.34%,A、B、C抑制细胞增殖的活性差异无统计学意义。结论:喙尾琵琶甲乙醇提取物可显著抑制人胚肺二倍体成纤维细胞的增殖,不同浓度乙醇提取物之间对细胞增殖的抑制作用相差不大。

不同pH值对人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5生长的影响

目的在不同pH值培养液中培养人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5),观察其生长情况,选出最有利于MRC-5细胞生长的pH值范围。方法采用细胞培养技术,分别在pH值为6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6的培养液中培养MRC-5细胞,通过显微技术观察细胞形态、对细胞进行计数,然后对MRC-5细胞的生长情况进行分析比较。结果在不同pH值的培养液中,MRC-5细胞的生长状况不同,细胞数量和细胞形态都有差异,当培养液的pH值为7.2-7.3时,细胞生长形态最好,细胞数量最高可达2.37×106/ml。结论研究表明,培养液的pH值为7.2-7.3时,MRC-5细胞的生长状况最佳。

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .

体外培养不同代次成纤维细胞胶原基因表达及成纤维细胞对EGF的反应性

目的 观察体外培养不同代次人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达及对EGF刺激的反应性。方法 将正常人二倍体成纤维细胞进行连续传代培养 ,以不同代次的细胞为实验对象 ,应用RT PCR、3 H TdR掺入量测定等方法对不同代次细胞进行检测。结果 随细胞代次的增加 ,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量逐渐降低 ,3 H TdR掺入量降低 ,EGF促进P10 培养的成纤维细胞增殖 ,对衰老成纤维细胞 (P60 )无生长增殖的调控能力。结论 为建立人成纤维细胞衰老模型提供部分实验依据。

有丝分裂诱导基因6(MIG-6)可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰.癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)是由一些连续癌症基因的信号,以阻止细胞增殖造成的反应.有丝分裂诱导基因6(mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因,是ErbB RTK通路的负调控因子,抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象,研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用.通过Western印迹发现,在老年细胞中MIG-6表达升高.利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中,通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6,然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组,生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.

山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。

山茱萸多糖对衰老HDF细胞cyclinD1、CDK4表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗人胚肺成纤维二倍体(HDF)细胞衰老的作用及其可能的细胞周期调控机制。方法体外培养HDF细胞,实验组从40代开始加山茱萸多糖含药血清。观察细胞形态;MTT法检测细胞活力;RT-PCR法检测细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)4的mRNA表达。结果衰老组细胞活力下降,cyclinD1mRNA表达升高,CDK4 mRNA表达下降;山茱萸多糖可提高细胞活力,降低cy-clinD1表达,提高CDK4表达量。结论山茱萸多糖可能通过改变细胞周期调控因子的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。

黄芪多糖对衰老HDF细胞染色体末端限制性片段长度的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)改善衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF细胞)衰老表型的机制。方法 HDF细胞连续传代培养,形成衰老细胞模型;采用MTT法检测细胞活力;免疫组化法检测β-半乳糖苷酶活性;DNA杂交法检测染色体末端限制性片段(TRF)长度。结果 APS提高衰老HDF细胞活力(P<0.05),降低了SA-β-gal表达(P<0.05);衰老HDF细胞TRF长度明显缩短(P<0.05),而APS可使TRF缩短速度降低(P<0.05)。结论 APS可以通过减慢TRF缩短速度,提高衰老HDF细胞活力,发挥抗衰老作用。

灵芝多糖抗H_2O_2诱导的HDF细胞衰老及其机制的研究

目的探讨不同剂量灵芝多糖(GLP)对抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及可能的细胞周期调控机制。方法将HDF细胞培养至24代时分成6组:即青年组、对照组、衰老模型组及GLP小剂量(50mg/L)、中剂量(100mg/L)、大剂量(150mg/L)组,体外DMEM培养,各GLP组和衰老模型组自30代始添加H2O2诱导HDF细胞衰老,直至38代。采用MTT法检测细胞活力;Dimri法检测β-半乳糖苷酶活性;RT-PCR法检测p16INK4a、CyclinD1、CDK4的表达;Western印迹法检测Rb蛋白表达和磷酸化Rb。结果与青年组及对照组比较,衰老模型组细胞活力下降(P<0.01),β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.01),CyclinD1 mRNA表达升高(P<0.01),CDK4 mRNA表达下降(P<0.01),p16INK4a表达升高(P<0.01),Rb磷酸化减少(P<0.01);与衰老模型组细胞比较,中剂量和大剂量GLP细胞活力明显提高(均P<0.01),而β-半乳糖苷酶活性降低(均P<0.01),CyclinD1 mRNA表达降低(均P<0.01),CDK4 mRNA表达升高(均P<0.01),p16INK4a表达降低,Rb磷酸化增多(均P<0.01),但两组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论GLP可通过改变细胞周期调控因子CyclinD1/CDK4/p16INK4a进而调节Rb的磷酸化状态,发挥抗H2O2诱导的HDF细胞衰老作用。

枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻2BS融合细胞DNA合成的影响

目的 :研究枸杞子、淫羊藿水提液对衰老 -年轻 2BS融合细胞DNA合成的影响。方法 :以人胚肺二倍体成纤维细胞国内标准株 2BS为衰老模型 ,用细胞脱核和细胞融合技术 ,观察枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻 2BS融合细胞的DNA合成的影响。结果 :2BS细胞分别在含 0 0 2 5 (V/V)枸杞子、淫羊藿水提液的DMEM培养液中 ,可连续培养至 6 1 0± 2 9、5 6 0± 2 6代 ,对照组为 4 9 0± 2 6代 (P <0 0 1) ;衰老的 2BS细胞分别用枸杞子、淫羊藿水提液处理 2h后 ,进行细胞脱核并与年轻 2BS细胞融合 ,其〔3H〕TdR掺入百分率明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论 :枸杞子、淫羊藿均能促进衰老 -年轻 2BS融合细胞的DNA的合成速率 ,延长 2BS细胞寿命。