人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达

目的拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)A亚单位蛋白。方法将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入sf9昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度。最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件。结果在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性。将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1代病毒的滴度为2×10^(7) pfu/m。蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为55 ku,主要在培养基中。蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1,最佳感染时程为72 h。结论本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功的糖基化修饰。该系统为其工业化平台的建设及生产提供前期基础,也针对日后TSHR蛋白的研究和Graves病的病因预防提供了有用的工具。

人促甲状腺激素受体抗原决定簇的研究进展

在环境和遗传因素基础上,机体免疫功能异常变化导致自身免疫性甲状腺疾病,促甲状腺激素受体抗体是其重要的自身抗体,它们属于异质性抗体,不同抗体诱发不同病理改变,每种抗体的相应抗原决定簇在促甲状腺激素受体上分布不尽相同,所致临床表现也迥然不同。确定不同抗体的相应抗原决定簇不仅有助于探讨其病理机制还具有临床诊治意义。

脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建

目的:构建阳离子脂质体包裹的人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒。方法:PCR扩增穿梭质粒PHMCMVTSHR289目的基因并连接于真核表达质粒pcD NA3.1+上,重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及测序法鉴定。阳离子脂质体包裹重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289。结果:重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示出现512bp条带。正向测序发现AAC突变为AAT,为同义突变。反向测序发现GCG突变为GCT,亦为同义突变。阳离子脂质体与重组质粒的体积质量比例为3∶1。结论:酶切及测序鉴定重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289构建成功。

人促甲状腺激素受体A亚基在大肠杆菌中的表达及免疫活性

目的构建人促甲状腺激素受体(TSHR) A亚基的原核表达载体pET102/D-TOPO/TSHR A,在大肠杆菌中表达并分析其免疫活性。方法采用逆转录—聚合酶链式反应扩增TSHR A基因编码序列,定向连接到载体pET102/D-TOPO中,经聚合酶链式反应、酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 StarTM(DE3);异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达TSHR A亚基融合蛋白,超声裂解细菌,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting鉴定,在变性、复性、镍柱纯化后,目的蛋白与Graves患者血清结合鉴定其免疫活性。结果成功构建pET102/D-TOPO/TSHR A亚基表达载体,优化融合蛋白表达条件,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定重组质粒可表达47 kD大小的特异性蛋白,Western blotting鉴定其被His抗体、鼠源性抗人促甲状腺激素受体多克隆抗体识别,复性后融合蛋白与Graves患者混合血清呈强阳性结合,正常人血清未有任何形式的结合。结论成功构建人促甲状腺激素受体A亚基原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了其亚基融合蛋白,该蛋白与Graves患者血清呈强阳性特异性结合。

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的构建人促甲状腺激素受体(hTSHR)稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的HEK293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHRHEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。

稳定表达全长人促甲状腺激素受体细胞株构建及功能评价

目的建立能稳定表达全长人促甲状腺激素受体的细胞株并对其进行功能鉴定。方法利用PCR方法钓取全长人促甲状腺激素受体（hTSHR）基因，纯化后交换进入线性化GV208载体，构建出重组载体，载体转化后在辅助包装原件载体质粒的帮助下包装成慢病毒颗粒，感染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），单克隆培养后筛选出稳定表达hTSHR的细胞，用qPCR检测其mRNA表达情况。用牛TSH（bTSH）或Graves病患者血清刺激细胞，检测上清cAMP浓度变化来鉴定构建的细胞株功能。结果基因检测证明阳性转化子目的基因序列正确。与对照组或空白组细胞相比，构建的实验组细胞株表达的hTSHRmRNA升高，在受到bTSH刺激时，随着bTSH浓度增加，cAMP明显增高，初发Graves病患者血清刺激细胞时，与对照组血清相比cAMP明显增高。结论构建的CHO细胞株能稳定表达全长人促甲状腺激素受体，并且该细胞株功能良好，可用于后续研究。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用

目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。

Graves病诊治中TRAb与血清FT_3、FT_4及TSH的相关性分析

目的通过观察TRAb在GD治疗前后的变化趋势以及TRAb与血清FT3、FT4、TSH的相关性,探讨TRAb初诊水平与TSH恢复时间的关系。方法 2012年8月至2013年12月期间,收集90例在武警总医院内分泌科门诊初次确诊的GD患者为研究对象。所有研究对象均给予甲巯咪唑片治疗,并在治疗前及治疗后每月测定血清FT3、FT4、TSH和TRAb水平。结果 90例患者在治疗前及治疗后第6、12个月时TRAb阳性率分别为97%、80%、50%,TRAb平均水平分别为(12.7±3.5)IU/L、(8.2±1.7)IU/L和(3.3±1.5)IU/L。治疗前与治疗后第6、12个月血清TRAb阳性率和平均值差异均有统计学意义(P<0.05)。扣除了变量FT3和FT4的影响后,TRAb与TSH的r值-0.22^-0.43,且差异均有统计学意义(P<0.01)。初诊时血清TRAb的水平与TSH首次恢复正常的时间存在正相关性(r=0.73,P<0.001)。结论 TRAb对血清TSH存在抑制作用,初诊时TRAb的值越高,则TSH首次恢复正常的时间也越长。

重组腺病毒Ad-TSHR289注射诱导Graves病小鼠模型

目的观察过表达人促甲状腺激素受体(TSHR) A亚单位的重组腺病毒(Ad-TSHR289)注射诱导Graves病(GD)模型的效果。方法 36只BALB/c小鼠,分为模型组(GD组)、正常对照组(NC组),每组各18只。GD组分别于第1、4周注射含2×109Pfu优化Ad-TSHR289腺病毒的PBS溶液; NC组分别于同时注射等量PBS溶液。造模后第7、13、18周两组各随机选取6只小鼠,摘眼球取血,检测血清T4、TRAb,处死两组小鼠取甲状腺组织,肉眼观察形态后HE染色观察两组甲状腺病理变化。结果与NC组比较,第7、13、18周GD组眼球血清T4含量及TRAb水平均增加(P均<0. 05)。第7、13、18周GD组成模数分别为6、6、6。与第7周比较,第13周GD组眼球血清TRAb水平降低(P <0. 05)。第7、13、18周,GD组小鼠甲状腺不同程度肿大、充血。NC组甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状,滤泡腔光滑,腔内充满均匀胶质。GD组甲状腺滤泡上皮细胞肥大,细胞呈高柱状,排列紧密,增生的细胞向滤泡腔内形成乳头状凸起,滤泡腔不光滑,腔内胶质明显减少、内含物增加,甲状腺组织内红细胞浸润明显。且随造模时间推移,甲状腺滤泡上皮细胞增生程度逐渐加重,滤泡腔逐渐变小。结论 2×109Pfu的Ad-TSHR289两次注射BALB/c小鼠第7周时即可成功构建GD模型,成模率和维持时间均较好。

1585例正常人及不同甲状腺疾病患者血清TRAb水平的临床研究

目的以制备的富含甲状腺刺激性抗体（TSAb）抗原决定簇的重组TrxTSHRn蛋白为抗原，建立酶联免疫吸附（ELISA）技术确定促甲状腺激素受体抗体（TRAb）的阳性剀限值，并初步应用于临床。方法以重组TrxTSHRn蛋白为抗原，通过不同的抗原包被量、不同的样品血清稀释度优化，建立间接ELISA检测方法（TRAb—NELISA以检测TSAb为主）。以此方法检测正常成人组1060例（年龄18～81岁），健康儿童27例及非自身免疫性疾病儿童（肺炎患儿）88例（年龄0—14岁，平均3．8岁），确定阳性切限值。检测不同甲状腺疾病患者血清TRAb水平。结果TRAb—NELISA检测正常成人组405nm处吸光度A405值（x±s）为0．398±0．167，儿童组为0．186±0．094，二者差异有统计学意义。亚组分析中，不同性别组之间及正常成人组各年龄段之间差异无统计学意义。成人组阳性切限值（x＋2s）为0．732，阳性率2．45％（26／1060）。初发Graves病患者阳性率70．31％（74／105）、治疗1年Graves病患者阳性率35．70％（10／28）、桥本甲状腺炎患者阳性率36．67％（44／120）、单纯甲状腺肿患者阳性率4．60％（2／43）、亚急性甲状腺炎患者阳性率6．67％（3／45）、非毒性结节性甲状腺肿患者阳性率7．25％（5／69）。结论儿童血清TSAb水平显著低于成人，而不同年龄、性别的成人之间TSAb水平无差异。初发Graves病患者TSAb阳性率较高，因此TSAb可用于Graves病的诊断、疗效观察及判断预后。