TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

p53及CCL2在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨肿瘤相关蛋白53(tumor associated protein 53,p53)及CC类趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2,CCL2)在胃癌组织中的表达水平及其与胃癌的临床病理特征之间的关系。方法应用免疫组织化学法检测191例胃癌及配对癌旁组织中p53及CCL2蛋白表达,同时将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果胃癌组织中p53及CCL2蛋白表达的阳性率分别为53.9%(103/191)和37.2%(71/191),而在癌旁组织中阳性率分别为14.1%(27/191)和25.1%(48/191)。胃癌组织中p53及CCL2蛋白表达阳性率均高于癌旁组织,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。p53蛋白表达在肿瘤分化程度、浸润深度和淋巴结转移方面比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。CCL2蛋白表达在肿瘤大小、浸润深度和TNM临床分期方面比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论 p53及CCL2蛋白表达情况与胃癌组织生长关系密切,其表达情况可能成为胃癌恶性程度的一个良好指标。

组蛋白甲基转移酶SETD2对P53介导细胞凋亡的调控

目的探讨组蛋白甲基转移酶SETD2对P53功能的调控。方法 PCR扩增人源SETD2并重组入真核表达载体;通过间接免疫荧光鉴定SETD2的亚细胞定位;通过GST Pull-down实验寻找P53结合SETD2的区域;流式细胞术分析SETD2对P53参与细胞凋亡的影响。结果成功克隆了人源SETD2的全长,并将其成功构建到真核表达载体中;SETD2以胞核定位为主;体外直接相互作用实验证实SETD2和P53存在相互作用,SETD2分子中部的SET结构域和C端都可以结合P53;流式细胞分析结果表明SETD2对于P53参与的细胞凋亡具有明显的促进作用。结论本研究揭示P53正向调控因子SETD2对P53介导的细胞凋亡具有促进效应,从而将组蛋白表遗传学修饰与P53转录因子活性调控关联起来,研究结果对肿瘤、免疫等疾病的防治具有一定的科学意义。