胰岛素样生长因子-I与透明质酸促人关节软骨细胞增殖的作用

为了探讨胰岛素样生长因子 I(IGF I)和透明质酸 (HA)联合培养对人关节软骨细胞增殖的影响 ,在人关节软骨细胞培养液中分别加入不同浓度的IGF I、HA、IGF I和HA ,用四氮甲基唑蓝 (MTT)法及流式细胞术测定软骨细胞增殖活性的变化。结果显示 ,10 μg L浓度的IGF I即可明显促进软骨细胞的增殖 ,IGF I浓度为 5 0 μg L时 ,其促增殖作用达最大值 ;单独应用HA对软骨细胞的增殖无影响 ;IGF I+HA组吸光度值为 0 377,较IGF I组增加 10 7% ;IGF I组促增殖的高峰时间为 72h ,IGF I+HA组的高峰时间为 96h ,培养 96h后 ,IGF I+HA组吸光度值 0 389,细胞的增殖指数为 2 8 79± 1 2 4 % ,较对照组升高更明显。说明IGF I具有促软骨细胞增殖作用 ,与HA联合培养促增殖能力更强 ,具有协同效应 。

miR-370-3P通过调节JAK2/STAT5B信号通路抑制人关节软骨细胞增殖

目的研究非编码单链RNA(micro RNA,miRNA)miR-370-3P是否通过调控JAK2/STAT5B信号通路调节人关节软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)的增殖,并探讨其潜在作用机制。方法 (1)通过脂质体转染HC-a细胞构建miR-370-3P过表达/低表达人关节软骨细胞模型,分为5组:miR-370-3P模拟物mimic组(miR-370-3P过表达组)、miR-370-3P遏制物inhibitor组(miR-370-3P低表达组)、正常对照组、mimic空载体对照组(mimic normal control,mNC)、inhibitor空载体对照组(inhibitor normal control,iNC)。(2)miRNA实时荧光定量PCR检测各组HC-a细胞miR-370-3P的表达。(3)qRT-PCR检测各组HC-a细胞JAK2、STAT5B mRNA表达。(4)Western blot检测各组HC-a细胞中JAK2、STAT5B蛋白表达。(5)MTT比色法检测各组HC-a细胞相对增殖情况。(6)双荧光素酶实验:构建JAK2、STAT5B野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与miR-370-3P模拟物和阴性对照序列共转染293T细胞,检测各组荧光素酶活性。结果 miRNA实时荧光定量PCR结果显示:与正常对照组相比,mimic组miR-370-3P表达上调(P<0.05),inhibitor组miR-370-3P表达下调(P<0.05),且空载体对照组和正常对照组之间的差异无统计学意义,表明miR-370-3P过表达/低表达软骨细胞模型构建成功。qRT-PCR结果显示:相比于正常对照组,JAK2和STAT5B在mimic组的mRNA相对表达量下调,在inhibitor组JAK2 mRNA和STAT5B mRNA相对表达量上调(P<0.05)。Western blot检测结果显示:JAK2和STAT5B蛋白表达在mimic组也有显著下调,在inhibitor组上调。MTT检测结果显示:miR-370-3P的过表达会降低HC-a的存活率(P<0.05),提示miR-370-3P的过表达会抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖。双荧光素酶实验结果显示:miR-370-3P和JAK2-WT(野生型)、STAT5B-WT(野生型)质粒共转染后,荧光表达较对照组有显著下调(P<0.05),提示miR-370-3P可与JAK2-3′UTR、STAT5B-3′UTR直接结合发挥作用。结论 miR-370-3P可通过直接靶向调控JAK2/STAT5B信号通路进而抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖。

人关节软骨来源CD105^+/CD166^+间充质干细胞的分选及其多向分化特性的鉴定

目的建立免疫磁珠技术高效分选人关节软骨CD166+/CD105+间充质干细胞(MSCs)的方法,并鉴定其多向分化特性。方法酶消化法获取5例手术切除的膝关节软骨组织细胞,并行原代(P0代)和传代(P2、P4、P6代)培养;流式细胞仪检测其中CD166+/CD105+细胞百分比。比较免疫磁珠连续法与间断法分选P4代培养细胞中CD166+/CD105+细胞的所需时间、分选细胞活度及其百分比和收获率。对连续法分选CD166+/CD105+细胞进行成骨、成软骨、成脂肪诱导,Gomori钙钴法碱性磷酸酶(ALP)、Ⅱ型胶原免疫组化、油红O染色检测其分化特性。结果人关节软骨组织分离细胞和原代培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比较低[(1.13±0.68)%、(5.16±3.59)%],传代培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比随传代次数增加而明显增高[P2、P4、P6代培养细胞中CD166+/CD105+细胞百分比分别为(12.68±2.59)%、(17.81±3.80)%、(19.36±3.93)%](P<0.05),传代培养至P4代,其CD105+/CD166+细胞百分比与P6代[(19.36±3.937)%]比较差异不显著(P>0.05)。免疫磁珠连续法分选P4代培养细胞中CD105+/CD166+细胞的百分比高于间断分选法[(93.8±3.95)%vs(90.1±2.43)%,P<0.05],且分选时间显著缩短[(6.8±0.40)hvs(120.0±10.21)h,P<0.01),而细胞收获率[(62.0±7.5)%vs(68.5±7.0)%]和细胞活度[(93.8±1.48)%vs(94.6±1.14)%]差异不显著(P>0.05)。连续法分选CD166+/CD105+细胞成骨诱导后ALP染色阳性;成软骨诱导前Ⅱ型胶原弱阳性,诱导后Ⅱ型胶原阳性;成脂肪诱导后,细胞内可见脂肪滴,油红O染色阳性。结论人关节软骨P4、P6代培养细胞中的MSCs比例较高。免疫磁珠连续法能够高效分选人关节软骨MSCs,所分选的MSCs具有成骨、成软骨及成脂肪分化功能。

人关节软骨细胞的体外分离、培养与鉴定

目的:研究人关节软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法,观察各代人关节软骨细胞的形态学特性。方法:取人创伤性截肢的无菌膝关节软骨,采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞,并进行传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行鉴定。结果:两步酶消化法消化出的软骨细胞呈圆形,培养2-3天,细胞贴壁、变形,呈三角形或多角形,2周左右细胞融合成层,传代5次后出现去分化。软骨细胞增殖和生长缓慢。形态学、免疫组织化学染色显示细胞培养5代以内可以保持表型的稳定。结论:本研究采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法获得大量高纯度、高活性的人关节软骨细胞。5代以内细胞生长良好,生物学特性明显,适合于实验研究,5代以后出现去分化现象。

人正常及骨关节炎关节软骨细胞的体外分离培养及鉴定

目的建立人正常关节及人骨关节炎(OA)关节软骨细胞体外分离、培养及鉴定方法,比较二者之间部分软骨细胞生物学特征的差异。方法取人正常及人OA关节软骨组织,用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞,进行原代、传代培养。采用生长情况观察、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对第2代软骨细胞进行比较。结果人正常关节软骨细胞生长及增殖快于人OA关节软骨细胞,且表型稳定;甲苯胺蓝及免疫组织化学染色显示人正常关节软骨细胞染色后异染颗粒的阳性表达均高于人OA关节软骨细胞。结论体外分离培养的人OA关节软骨细胞符合软骨细胞退变的表现,可为OA的相关实验研究提供细胞来源。

纳米细菌对人关节软骨细胞生物学形态的影响

目的观察纳米细菌损伤人膝关节软骨细胞的方式和特点。方法正常人膝关节软骨细胞分为高浓度组、中浓度组、低浓度组和对照组,分别加入吸光度值为0.280、0.035、0.002、0的纳米细菌液进行攻击,加入纳米细菌液24、48h时光镜下观察4组膝关节软骨细胞形态学变化及存活率,免疫荧光染色法观察中浓度组加入纳米细菌液0、1、2、4、8h时纳米细菌与软骨细胞的位置关系,流式细胞仪检测加入纳米细菌液24h时4组软骨细胞凋亡率。结果高浓度组加入纳米细菌液24h、中浓度组加入纳米细菌液48h,光镜下大部分软骨细胞坏死甚至未见完整细胞形态;加入纳米细菌液24、48h时,高浓度组软骨细胞存活率吸光度值(0.413±0.046、0.345±0.125)低于中浓度组(0.496±0.039、0.708±0.043)、低浓度组(0.539±0.047、1.018±0.048)和对照组(0.577±0.045、1.133±0.127)(P<0.05),中浓度组低于低浓度组和对照组(P<0.05),低浓度组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);纳米细菌可在较短时间内侵入至软骨细胞中,且随时间延长软骨细胞内纳米细菌荧光颗粒数目增多;加入纳米细菌液24h,高、中、低浓度组和对照组软骨细胞凋亡率[(1.541±0.046)%、(1.546±0.039)%、(1.539±0.047)%、(1.527±0.045)%]比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论纳米细菌可损伤人关节软骨细胞,短时间内(24h)被攻击的软骨细胞未发现明显凋亡,高浓度纳米细菌可造成人关节软骨细胞更严重损伤。

连翘酯苷A对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响

目的探讨连翘酯苷A对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的软骨细胞损伤的影响及其可能的作用机制。方法采用50 mg/L IL-1β诱导人关节软骨细胞建立细胞损伤模型,记为模型组;另取未处理细胞为对照组。采用1.25、2.5、5.0μmol/L不同浓度的连翘酯苷A处理软骨细胞,依次记为连翘酯苷A低、中、高剂量组。ELISA法检测炎症因子[IL-1β、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]水平;采用流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测circSERPINE2表达量。pcDNA、pcDNA-circSERPINE2转染至软骨细胞后用IL-1β处理,si-NC、si-circSERPINE2分别转染至软骨细胞后用连翘酯苷A与IL-1β共同处理24 h,采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果连翘酯苷A作用于IL-1β诱导的软骨细胞后,炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白、circSERPINE2表达水平升高(P<0.05);转染pcDNA-circSERPINE2后炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平及细胞凋亡率、Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);转染si-circSERPINE2后,炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。结论连翘酯苷A可通过上调circSERPINE2表达而抑制细胞炎症因子表达及细胞凋亡,从而减轻IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤。

直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:软骨细胞和间充质干细胞都可用于构建组织工程化软骨,但体外培养的软骨细胞容易发生去分化,表型难以维持,以致其临床应用受到限制。目的:探讨人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞直接共培养对人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化的影响,以及直接共培养的最佳比例。方法:分离培养人脐带间充质干细胞并通过流式细胞仪鉴定表面标志。实验分为6组:直接共培养组按照人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞比例为1∶1,3∶1及5∶1(人脐带间充质干细胞∶人关节软骨细胞)进行共培养;阳性对照组用转化生长因子β1细胞因子诱导;人关节软骨细胞空白对照组和人脐带间充质干细胞空白对照组。免疫荧光细胞化学检测Ⅱ型胶原(COL2A1)的表达水平;Western blot检测细胞SOX9Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原蛋白表达水平;实时荧光定量qRT-PCR检测SOX9、Col1a1、Col2a1 m RNA表达。结果与结论:(1)成功分离并鉴定人脐带间充质干细胞;(2)人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养28 d后,共培养组及单独药物诱导的阳性对照组Ⅱ型胶原免疫荧光检测均呈阳性;(3)阳性对照组的Col2a1 mRNA表达水平高于共培养组,但Ⅱ型胶原蛋白表达总量低于共培养组,1∶1共培养组的Col2a1 mRNA表达水平高于3∶1和5∶1共培养组。阳性对照组和共培养组的Col1a1 m RNA表达水平和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均低于人关节软骨细胞空白对照组。(4)结果说明,人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞直接共培养可明显促进人脐带间充质干细胞向软骨样细胞诱导分化,并有效抑制细胞纤维化,从缩减软骨细胞用量方面看,直接共培养体系的适宜比例为5∶1。采用直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的成本较低,是一种较为经济合理的诱导方法。

IL-1β诱导骨关节炎细胞模型中FSTL1蛋白的表达及意义

目的探究卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在人关节软骨细胞内的表达情况及意义。方法采用IL-1β刺激人关节软骨细胞24 h建立细胞模型。免疫荧光技术检测FSTL1在正常人软骨细胞内的表达情况;Western Blot对IL-1β诱导的人关节软骨细胞FSTL1表达水平进行检测。结果免疫荧光结果显示,在正常人软骨细胞内FSTL1蛋白表达广泛且主要分布在细胞质;Western Blot结果显示,IL-1β诱导的人软骨细胞中FSTL1蛋白表达与正常组相比显著减少(P<0.01)。结论IL-1β诱导显著抑制人关节软骨细胞FSTL1蛋白表达,FSTL1可能是骨关节炎治疗的关键靶点。

骨性关节炎系列讲座——骨刺是如何形成的?

或许没有一种病会像骨性关节炎那样普遍地困扰着人类。据统计,人的一生中几乎没有谁能幸免于骨性关节炎的折磨。 骨性关节炎,老百姓称之为骨刺。它是一种骨组织随年龄增大而发生的退行性改变,就像人老了头发会逐渐变白一样。

不同浓度地塞米松对人骨关节炎软骨细胞凋亡及Fas/FasL基因表达的影响

目的糖皮质激素会破坏软骨,通过观察地塞米松对人骨关节炎软骨细胞(human articular chondrocytes,HACs)凋亡及Fas/FasL基因表达的影响,探讨其促进HACs凋亡的作用机制。方法取行人工膝关节置换的膝骨关节炎患者自愿捐赠软骨组织,体外分离培养HACs,取第2代细胞进行实验。将HACs分别置于含浓度为0.125、1.25、12.5、25及50μg/mL地塞米松培养液中,培养48 h后采用MTT法选择地塞米松最佳工作浓度进行后续实验。将HACs分别采用最佳工作浓度地塞米松(实验组)及不含地塞米松培养液(对照组)培养,0、24、48 h后行TMRE/Hoechst/Annexin V-FITC/7-AAD四重染色检测细胞凋亡,48 h后行实时定量PCR检测Fas/FasL mRNA表达,0、24、48 h后行免疫组织化学染色检测Fas/FasL蛋白表达。结果 25μg/mL浓度组细胞抑制率显著高于50μg/mL浓度组,差异有统计学意义(P<0.05);与其他浓度组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05);选择25μg/mL浓度作为后续实验工作浓度。培养0、24、48 h,实验组HACs凋亡细胞百分比分别为5.8%±0.3%、27.0%±2.6%、36.0%±3.1%,呈明显时间依赖性(P<0.05)。培养48 h后实验组及对照组Fas mRNA相对表达量分别为(8.93±1.12)×10—3及(3.31±0.37)×10—3,FasLmRNA相对表达量分别为(5.92±0.66)×10—3及(2.31±0.35)×10—3,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。随培养时间延长,实验组Fas及FasL蛋白表达逐渐增加,且各时间点均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论地塞米松可促进HACs细胞凋亡及上调凋亡基因Fas/FasL表达,为进一步探讨Fas/FasL信号通路在地塞米松促HACs凋亡中的作用提供了实验依据。

哪些患者要做下肢“截骨术”?

一个星期天,我坐在公园的椅子上休息,无意中发现从我身边走过的老年女性中,竟然有许多人患有膝内翻。出于职业习惯,20分钟内的观察告诉我,竟然有10余人需做截骨术治疗。

人异体骨软骨移植物保存方法研究

[目的]探讨六种保存方法对人关节软骨组织结构和细胞活性的影响,寻求一种保存效果较好的方法,为临床提供一种有活性的异体骨软骨移植物。[方法]自捐献新鲜尸体膝关节利用专用手术器械获取4.5 mm×4.5 mm大小的人骨软骨块,分别采用梯度降温法、Co60射线照射+梯度降温法、玻璃化法、连续降温法、直接液氮法和酒精浸泡法对软骨块进行保存处理,分别于保存第8、15、30、60 d时,采用蕃红-O组织染色、扫描电镜、软骨细胞胎盼蓝染色、MTT法等,观察并比较以上6种方法保存后关节软骨细胞存活率及其代谢功能变化。[结果]除了酒精保存方法外,其余保存方法随着时间延长软骨组织的细胞成活率和细胞代谢活性逐渐降低;保存60 d时,采用玻璃化法保存软骨组织的细胞存活率为62.47%,软骨基质成分丢失较少,胶原纤维断裂不明显;采用慢速梯度降温法保存软骨组织的细胞存活率为59.75%,软骨基质成分丢失较多,胶原纤维断裂明显;其他保存方法软骨细胞存活率不足40%,软骨基质成分大量丢失,胶原纤维杂乱。[结论]六种保存方法中,玻璃化保存法能够较好的保存关节软骨,活性最好,其次是梯度降温保存法,两者均具有一定临床价值。Co60射线照射对软骨细胞有一定的损伤作用;酒精浸泡不能保存软骨细胞活性。

优化底物酶及冻存剂组成对软骨细胞增殖力及活力的影响

[目的]本文研究的目的在于找到软骨细胞分离的合适方法及优化冰冻保存软骨组织的配方。[方法]来源于骨关节炎膝关节置换术的软骨标本被用于本次试验,采用300或400 u/ml II型胶原酶(CTII-1或2)进行软骨细胞体外分离,保存在不同组成的冷冻剂中,进行梯度冷却并保存在液氮中48 h,随后进行软骨细胞活力及增殖潜力的测定。[结果]CTII-1较CTII-2更能分离出高活力的软骨细胞(P<0.05),并且300或400 u/ml的底物酶浓度比较合适。10%DMSO+90%FCS是一种比较合适的冰冻保护剂,能够最大程度保留软骨细胞的增殖潜力与活力,并且毒副作用小。[结论]通过相关的优化措施诸如软骨细胞体外分离底物酶以及冰冻保护剂的组成,从关节软骨组织中分离具有高增殖潜力的活力软骨细胞是一种可行的方法。