人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549细胞后,在Id3mRNA水平和蛋白表达水平均有不同程度的抑制作用。结论成功构建了针对人Id3基因的4组pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3miRNA表达载体,其中,SRId3-1干扰组在mRNA水平和蛋白表达水平均能有效抑制A549细胞Id3的表达。

人分化抑制因子Id-3基因在大肠埃希菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备

目的在大肠杆菌中表达人Id-3与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-3的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-3的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Id-3融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性。通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-3融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体。结果经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-3基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为39000GST-Id-3融合蛋白。ELISA和琼扩试验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-3融合蛋白发生特异性反应。结论Id-3基因在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-3及其在各种组织中的表达水平提供了一种检测途径,也为分析Id-3分子结构、抗原表位和生物学功能奠定了基础。