大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。

人前脑啡肽原绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建人前脑啡肽原(preproenkephalin,PENK)绿色荧光真核表达载体并进行鉴定。方法参照PENK基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自酶切位点。通过RT-PCR的方法从正常人脑组织中扩增出目的基因,并定向克隆至pEGFP-C3绿色荧光蛋白真核表达载体上。筛选阳性克隆,通过双酶切和测序法鉴定重组质粒。结果双酶切结果与目的基因表达的条带完全吻合,克隆测序结果与NCB I收录的PENK序列完全一致。结论成功构建pEGFP-C3-PENK载体,为进一步研究疼痛的基因治疗奠定基础。

携带可调控人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建四环素调控的含人前脑啡肽原基因(hPPE)逆转录病毒载体。方法用PCR方法扩增目的基因hPPE,定向克隆入逆转录病毒四环素反应质粒(pRevTRE)中,酶切反应、PCR 及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE;在脂质体介导下分别将pRevTRE/hPPE和逆转录病毒四环素调节质粒(pRevTet-on)转入包装细胞PT67,经相应的抗生素稳定筛选得到抗性细胞克隆。RT-PCR鉴定得到阳性产病毒细胞系PT67/Tet-on和PT67/TREhPPE。用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果经限制性酶切分析、RT-PCR及DNA序列分析证实pRevTRE/hPPE中含有hPPE基因。转染有pRevTet-on的FT67细胞病毒滴度为2.6×105 CFU/ml,转染有pRevTRE/hPPE的PT67细胞病毒滴度为3.2×105 CFU/ml。结论成功构建了含有受四环素调控hPPE基因的逆转录病毒载体,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为可调控细胞移植镇痛的研究奠定了实验基础。

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。

可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建

目的:构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株(IAST).方法:应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因(hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒(pRe-vTRE/hPPE);以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTet-On分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清;将含有RevTet-On病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRE-Luc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/Tet-On细胞株;再将RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/Tet-On细胞株,得到稳定表达脑啡肽的IAST/Tet-On/hPPE细胞株,通过RT-PCR、免疫细胞化学及间接免疫荧光染色检测该细胞株中强力霉素定量调控脑啡肽的表达.结果:重组逆转录病毒载体pRe-vTRE/hPPE构建成功;经挑选得到了高表达、低背景IAST/Tet-On细胞株,其诱导倍数为20.6;在IAST/Tet-On/hPPE细胞株中,hPPE基因表达受强力霉素调控,呈剂量依赖关系.结论:成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的永生化IAST,为可调控基因治疗慢性疼痛的研究奠定了基础.

强力霉素诱导表达脑啡肽细胞株的构建及其对慢性神经痛大鼠的镇痛作用

目的构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株,并评价鞘内移植该细胞对慢性坐骨神经压榨性损伤(CCI)大鼠的镇痛效应。方法应用逆转录病毒转染法,建立受强力霉素调控表达人前脑啡肽原基因(hPPE)的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/Tet-On/hPPE),实时定量PCR及放射免疫分析法检测强力霉素对该细胞株脑啡肽表达的定量调节。将IAST/Tet-On/hPPE细胞植入CCI大鼠蛛网膜下腔,观察腹腔注射强力霉素对其镇痛效应的影响及免疫组织化学检测脊髓背角Fos蛋白的表达。结果实时定量PCR及放射免疫分析结果显示,强力霉素可定量调控IAST/Tet-On/hPPE细胞株中脑啡肽的表达;IAST/Tet-On/hPPE植入CCI大鼠的蛛网膜下腔后,大鼠机械缩爪阈值升高(P<0.05),脊髓背角浅层Fos蛋白表达明显降低(P<0.05),且该镇痛效应受强力霉素调控。结论成功构建了可调控的定量表达脑啡肽的永生化星形胶质细胞株,其有望成为慢性疼痛治疗的新方法。

Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞对骨癌痛大鼠镇痛作用及其机制的探讨

目的观察鞘内注射稳定表达人前脑啡肽(HEEP)的HEK293细胞对骨癌痛大鼠痛觉的影响,探讨其与脊髓背角蛋白激酶Cγ(PKCγ)表达的关系。方法选取40只雌性SD大鼠,随机分为4组:Naive组,CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组,每组10只。对CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组造骨癌痛模型。模型建立成功后,分别对CIBP+HEK293组和CIBP+HPPE组大鼠鞘内注射Ubc-GFP-L.V/HEK293细胞和Plv-UbC-HPPE/HEK29细胞。术前1d和从术后3d开始每隔3天测定各组大鼠的热缩足反射潜伏期(PWTL)。使用免疫组织化学法检测大鼠脊髓背角PKCγ的表达。结果鞘内注射细胞后,CIBP+HPPE组大鼠各时点PWTL较CIBP组和CIBP+HEK293组明显升高(P<0.05)。CIBP+HPPE组大鼠脊髓背角PKCγ的蛋白表达量明显低于CIBP组和CIBP+HEK293组大鼠(P<0.05)。结论鞘内注射Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞使骨癌痛大鼠疼痛明显减轻,其镇痛作用可能与抑制脊髓背角PKCγ的蛋白表达有关。

鞘内注射HPPE修饰的HEK293对骨癌痛大鼠脊髓背角pCREB表达的影响

目的观察鞘内注射HPPE基因修饰的HEK293重组细胞(pLV-UbC-HPPE/HEK293),对骨癌痛大鼠行为学和脊髓背角pCREB表达的影响,探讨该重组细胞对大鼠骨癌痛的镇痛作用。方法雌性SD大鼠48只,随机分成两组,假手术(SHAM,12只)组和骨癌痛(CIBP,36只)组。大鼠左后肢胫骨打孔,SHA组大鼠注射生理盐水5ul,CIBP组大鼠注射MADB-106癌细胞5ul。于术前1d,术后7、14、21d分别测缩足反射潜伏期(PWL)X线下观察造模部位。将CIBP组随机分为CIBP′,CIBP′+GH,CIBP′+HH组,均12只。行鞘内穿刺并留置导管,分别注射PBS,GH和HH细胞悬液各20ul,隔天,共3次,测定PWL。CIBP′+HH组腹腔注射纳洛酮,再测PWL。实验结束后处死大鼠,取L4～L6脊髓,采用免疫组化法计数pCREB免疫反应阳性细胞数量。结果 (1)CIBP组术后7、14、21dPWL进行性下降(P<0.05),X线显示逐渐骨破坏;SHAM组差异无统计学意义(。2)CIBP′+HH组鞘内注射HH细胞后,PWL增高至(11.68±1.04)s,(P<0.05)(。3)CIBP′+HH组腹腔注射纳洛酮后PWL值降至(9.37±1.14)s,具有统计学意义(P<0.05),镇痛效应可被拮抗(。4)pCREB表达量:与CIBP′组相比,CIBP′+HH组降至(38.73±3.92),具有统计学意义(P<0.05)。结论鞘内注射HPPE基因修饰的HEK293细胞后,大鼠行为学变化和脊髓背角pCREB表达降低,表明该重组细胞对大鼠骨癌痛有镇痛效果。