胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较

目的:作为理想的种子细胞,成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method,ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method,EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF),以探讨两种方法的优缺点。方法:ITCM是将剪碎的皮肤组织置0.1%Ⅱ型胶原酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15 min,待组织块贴壁于培养皿后进行培养。EDM是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,将真皮组织再次于4℃下用0.1%Ⅱ型胶原酶消化过夜,然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压,用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网,对得到的细胞悬液进行培养。ITCM与EDM均采用两种酶进行消化,但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同,最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。本研究利用ITCM和EDM分离、培养HFF,观察ITCM组和EDM组HFF的原代至第3代(Passage 0~Passage 3,P0~P3)的细胞形态;染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度;绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。采取120 mJ/cm^(2)的中波紫外线(medium-wave ultraviolet,UVB)照射P3 ITCM组和EDM组HFF,建立光损伤模型。根据有无照射紫外线,实验分为UVB组和未照射对照组(Control)。采取二次离心法提取贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),用含不同浓度(0,2.5%,5.0%及10.0%)PPP的完全培养基对ITCM组和EDM组的HFF进行分组培养,加入PPP 24 h后用CCK-8试剂盒检测损伤细胞的增殖情况。结果:ITCM组培养至第3天时可观察到大量HFF,受杂质影响小;EDM组HFF形态的观察受到较多杂质影响;第9天时,两组细胞均可传代;两种方法体外分离培养的HFF均呈长梭形、旋涡状生长。HFF培养至P2时ITCM组和EDM组波形蛋白的阳性率比较差异有统计学意义[(97.36±0.76)%vs(99.4±0.56)%,P<0.01],CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(70.8±0.46)%vs(78.37±0.75)%,P<0.01],pan-keratin的表达分别为阳性和阴性。HFF培养至P3时ITCM组与EDM组比较,波形蛋白和角蛋白染色结果差异无统计学意义(均P>0.05),CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(74.73±1.37)%vs(85.27±2.63)%,P<0.001]。EDM组P3 HFF的增殖能力显著高于ITCM组(P<0.05)。经UVB(120 mJ/cm^(2))照射后,两种方法获取的HFF出现光损伤改变;2.5%PPP组修复损伤细胞的能力显著高于其余浓度组(P<0.05或P<0.001)。结论:与ITCM法比较,EDM法获得的HFF具有纯化速度快、增殖能力强的优点;PPP对HFF的紫外线损伤具有修复作用。实验结果可为后续临床治疗研究提供理论依据。

人孤雌胚胎干细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状态

人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)体外培养常需饲养层的支持以保持干细胞特性.通过原代培养获得人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,hFFs)并将其制备成饲养层,使hPESCs在hFFs上进行体外培养及传代.倒置显微镜下观察hPESCs的生长状态,采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)检测、核型分析和体内分化实验研究hPESCs的生物学特性及分化潜能,以探索hFFs能否长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.经原代培养成功获得了hFFs,通过形态学观察和免疫细胞化学染色鉴定符合成纤维细胞的生物学特性;在hFFs上生长的hPESCs克隆形态规则,不易分化;已成功在体外培养20余代,hPESCs仍能够保持基本生物学特性和正常核型,在裸鼠体内可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤.作为人源性饲养层,hFFs可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.

美罗培南挽救细胞培养中受细菌污染的人包皮成纤维细胞的研究

目的研究美罗培南挽救细菌污染的人包皮成纤维细胞(hFFs)的效果,并对成功挽救的hFFs的形状及增殖能力进行研究.方法将14批在培养中已发生细菌污染的hFFs随机分为美罗培南组和双抗组,分别用美罗培南法和双抗法对发生细菌污染的hFFs进行挽救.倒置显微镜下观察获得挽救的hFFs的细胞形态,测定细胞生长曲线.结果美罗培南组成功挽救了6批受细菌污染的hFFs,双抗组仅成功挽救了1批细胞.挽救成功的hFFs的细胞形态和增殖能力无明显改变.结论美罗培南可以有效消除hFFs的细菌污染,对hFFs细胞形态和增殖特性没有影响,为珍贵细胞污染提供了参考.

对数生长与G_0期人包皮成纤维细胞Stat1对INF-α刺激反应的差异

Stat1 (信号转导与转录活化子 1 )的激活与刺激因子和细胞组织类型有关 ,它的活化受体有组织分布特异性 .本研究比较 G0 期和对数生长周期两个不同状态体外培养的人包皮成纤维细胞受到干扰素 ( INF-α)刺激后 Stat1基因 m RNA、蛋白质表达以及蛋白质合成效率的差异 .结果表明 :成对数生长的细胞 Stat1的m RNA表达量较对照组增加达 1 0倍左右 ,蛋白质表达增加 3～ 4倍左右 ;G0 期细胞 Stat1的 m RNA表达量较对照组增加约 3～ 4倍 ,蛋白质表达增加约 3～ 4倍 ;对数生长细胞 Stat1蛋白质合成效率明显降低 ,在翻译水平可能有调控 .以上结果提示对数生长和 Go 细胞对

miR-17对人包皮成纤维细胞衰老的影响

目的探讨miR-17对人包皮成纤维细胞(HFF)衰老的影响。方法 miR-17重组慢病毒感染细胞,qRT-PCR确定感染效率,CCK-8法观察miR-17对细胞增殖的影响,衰老相关β-半乳糖苷酶染色观察miR-17对细胞衰老的影响,流式细胞法检测miR-17对细胞周期的影响,Western blotting检测cyclin D1和p21蛋白的表达。结果成功分离得到HFF,并建立了稳定表达miR-17的HFF-miR-17细胞系。且HFF-miR-17细胞增殖能力明显升高,β-半乳糖苷酶染色阳性率降低;S期细胞群比例明显增高,细胞周期蛋白cyclin D1表达显著上调,p21蛋白明显下调。结论 miR-17可通过上调cyclin D1蛋白、下调p21蛋白促进原代细胞的增殖,抑制原代细胞的衰老。

人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞体外培养弓形虫速殖子

目的 比较弓形虫RH株速殖子在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内的增殖情况. 方法 按照弓形虫速殖子∶细胞为1∶1的比例将弓形虫RH株速殖子分别与人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞共培养0、6、12、24、48 h后,于显微镜下观察细胞内虫体增殖情况.在两种细胞培养瓶中分别接种弓形虫RH速殖子,连续传代,每隔10代取弓形虫速殖子,将其密度调整为1×10^7个/ml,0.3 ml/只,腹腔接种ICR健康小鼠,记录小鼠存活时间. 结果 在相同条件下弓形虫速殖子侵入人巨噬细胞的时间早于侵入人包皮成纤维细胞的时间;共培养48 h时,绝大部分弓形虫速殖子胀破细胞,游离在细胞外.在两种细胞培养瓶中分别接种3×106弓形虫RH速殖子,约72 h后均可获得大量游离的弓形虫速殖子,2～3d传1代.人巨噬细胞内连续传代约30次,每代可获得（1×10^7～4×10^7）个速殖子,约增殖3～13倍;人包皮成纤维细胞中连续传代30次,每代可获得（1×10^7～3×10^7）个速殖子,约增殖3～10倍.弓形虫速殖子传代次数为10、20和30代时,人巨噬细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.3±0.5）、（4.0±0.8）、（4.3±1.2）d,人包皮成纤维细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.0±0.0）、（3.7±0.9）、（4.3±0.5）d,各代之间差异无统计学意义（P＞0.05）,弓形虫速殖子毒力未见明显改变. 结论 弓形虫RH株速殖子可在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内增殖并长期稳定传代.

草莓叶水提物对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原及分泌骨形态发生蛋白-1的影响

草莓叶水提物(water extractions from strawberry leaves,SLWE)富含多种生物活性成分,能促进成纤维细胞(fibroblasts,FB)合成胶原蛋白,而胶原蛋白只有经过骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP-1)的剪切才能变成有活性的蛋白。该文通过对SLWE主成分分析及主要酶活力测定,同时探究SLWE对人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1)合成胶原蛋白I(collagen I,COL I)及分泌BMP-1的影响。结果表明:SLWE中维生素C、原花青素、多糖、总黄酮、总酚、蛋白质的含量分别为(0.88±0.025)、(0.28±0.027)、(10.00±0.278)、(1.47±0.052)、(2.05±0.031)、(0.10±0.003)mg/mL;超氧化物歧化酶、过氧化物酶的酶活力分别为125.59、0.06 U/mL;SLWE对HFF-1细胞增殖作用不明显,但具有促进其COL I表达和增加BMP-1分泌量的作用。实验结果表明SLWE含有丰富的活性成分,具有促进HFF-1中COL I分泌和成熟的作用,且此功效并非通过增加细胞数量而实现的。综上所述,SLWE具备作为延缓衰老化妆品的功效成分的潜能,为草莓叶等废弃物资源再利用提供了理论依据。

人工培植冬虫夏草水提物抗人巨细胞病毒的研究

研究人工培植冬虫夏草水提物对人类巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用,并对其抑制机制进行初步研究。通过细胞病变法(CPE)检测虫草水提物的细胞毒性及抗病毒活性,同时采用免疫印迹实验(Western Blot-ting)初步探究虫草水提物抗HCMV的作用靶点。结果表明虫草水提物浓度在0.3 g.L-1以上时能有效抑制HCMV在宿主细胞中的复制,用虫草水提物处理感染的宿主细胞,HCMV的早期立即蛋白IE1、IE2及早期蛋白UL84的表达均明显受到抑制。虫草水提物可作为潜在的抗HCMV药物。

基因芯片分析弓形虫感染宿主细胞microRNAs差异表达

目的:研究弓形虫感染人包皮成纤维细胞(HFFs)的microRNAs(miRNAs)差异表达。方法:基因芯片分析弓形虫感染的HFFs的miRNAs差异表达,并用实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证miRNAs差异表达。结果:弓形虫感染HFFs的46种miRNAs表达量有1倍以上上调,37种miRNAs表达量有1倍以上下调。其中4种差异表达的miRNAs的实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证结果与基因芯片分析结果一致。结论:弓形虫感染可导致宿主细胞的miRNAs差异表达,差异表达的miRNAs可能在弓形虫和宿主细胞的相互作用中起调控作用。

参芪止疱颗粒抗HSV-2的体外实验研究

目的:探讨参芪止疱颗粒体外抗HSV-2的作用。方法:利用HFF感染HSV-2,用参芪止疱颗粒予以干预,以ACV做对照药,采用CPE法和MTT法进行实验。结果:实验发现HSV-2的TCID50为104;参芪止疱颗粒对HFF的CC50值大于10mg/ml,表明其对HFF的毒性作用小;在药物直接抗病毒复制实验中,参芪止疱颗粒对感染细胞EC50为0.30mg/ml,TI>36表明其对HSV-2感染HFF具有一定保护作用;在HSV-2感染HFF的治疗实验中,参芪止疱颗粒EC50值为0.60mg/ml,TI>25,提示其对病毒感染后复制有一定的抑制作用;其对HSV-2复制的抑制作用时相主要在感染后0h、2h、4h。但是,其对HSV-2感染细胞无预防作用。结论:参芪止疱颗粒在体外试验中具有较好的抗HSV-2的作用,值得临床进一步推广。

pSG5-pp71基因重组质粒在HFF中的表达与纯化鉴定

目的通过鉴定pSG5-pp71基因重组质粒,观察pp71基因在人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达,并对其进行纯化和鉴定。方法在HFF培养的基础上,通过分子克隆技术对重组质粒进行筛选,再应用基因工程技术对其纯化鉴定。结果pSG5-pp71基因重组质粒在HFF中得到高效表达。结论pp71基因能在HFF中稳定表达,为下一步抗HCMV pp71人源化基因工程抗体库的建立、筛选奠定了基础。

草莓叶水提物对UVB致皮肤损伤的保护作用

为了评价草莓叶水提物(SLWE)延缓皮肤衰老功效,对SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力进行了测定;探讨了SLWE对人包皮成纤维细胞(HFF-1)细胞活率、HFF-1中透明质酸(HA)、人Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、羟脯氨酸(HYP)、人基质金属蛋白酶1(MMP-1)、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量的影响。在中波紫外线(UVB)致HFF-1损伤模型基础上,考察了SLWE对保护组活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影响,探讨SLWE对UVB致HFF-1损伤保护机制。结果表明,SLWE富含VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类物质,其中,槲皮素含量12.86 mg/L,表儿茶素含量10.13 mg/L。SLWE自由基清除能力良好,清除不同自由基能力依次为O2–·>DPPH·>ABTS·>亚铁离子螯合>·OH;体积分数为1%的SLWE水溶液对NEG的抑制率为87.17%;体积分数大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLⅠ和HYP含量(p<0.05),体积分数为6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(p<0.01),表明SLWE具有提升皮肤含水量,增加胶原含量,抑制胶原降解,实现延缓衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而产生的ROS,体积分数6%的SLWE水溶液可显著降低MDA含量,抑制MMP-1表达,提高SOD活力,说明SLWE有助于缓解氧化应激造成的细胞损伤。

抗人白介素-17RA单克隆抗体的制备及活性检测

目的制备具有中和人白介素-17RA(h IL-17RA)免疫活性的单克隆抗体,并探讨其生物学活性。方法通过基因工程技术制备抗h IL-17RA的单克隆抗体。采用OctetRED系统检测其亲和力,ELISA、Western blot和流式细胞术分析抗体的结合作用和种属交叉反应,人包皮成纤维细胞-1上细胞因子分泌实验检测抗体的中和活性。结果抗h IL-17RA单克隆抗体亲和力常数KD<1.0×10^(-12)mol/L,并与其他物种有一定的交叉结合反应,它能结合白介素(IL)-17RA并有效阻断其与配体的结合,抑制下游相关细胞因子IL-6、IL-8和人CXC趋化因子配体1的分泌。结论成功制备1株抗h IL-17RA的中和抗体,为IL-17RA相关疾病通路的研究提供了工具,也为IL-17RA靶点药物的开发奠定了一定的基础。

人孤雌胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立

目的建立一种安全、有效、经济且适于人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stemcells,hPESCs)体外培养的无饲养层培养体系。方法将常规体外培养的hPESCs分别以mTeSRTMl培养基(对照组)和人包皮成纤维细胞的条件培养基(human foreskin fibroblasts-conditional medium,hFFs-CM)(实验组)扩增培养,倒置显微镜下观察两组无饲养层培养体系下hPESCs的生长状态;采用ALP检测和核型分析研究hPESCs生物学特性;采用RT-PCR检测hPESCs全能性标记物Oct-4的表达情况;通过体外和体内分化实验观察hPESCs向3个胚层分化的潜能。结果两组hPESCs形态规则、不易分化,在形态、扩增速度等方面无明显差异;已成功在体外培养15代,两组均能保持正常女性的二倍体核型46,XX和全能性;RT-PCR检测示两组Oct-4 mRNA均呈阳性表达;体外分化均可形成拟胚体;在裸鼠体内均可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤。结论 hFFs-CM无饲养层培养体系可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态,成功建立了一种不仅能维持hPESCs的有效扩增、减少动物源性污染、降低培养成本,还可满足临床大规模应用的hPESCs无饲养层培养体系。

人胚胎干细胞系HUES4的培养和染色体核型分析

目的建立人胚胎干细胞无动物源性饲养层培养方法,同时对长时间体外培养的人胚胎干细胞核型变化进行分析。方法人胚胎干细胞系HUES4细胞分别培养于小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞饲养层,并对其干细胞特性进行鉴定;在培养传代过程中,收获P27、P34、P41和P44细胞进行染色体核型分析,P27细胞还进行DNA短串联重复序列多态性分析。结果生长于人包皮成纤维细胞饲养层的HUES4细胞碱性磷酸酶染色以及SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原阳性,SSEA-1抗原阴性。所检测的4代细胞中均见46,XY/46,XY,t（9;15）（q22;q26）核型嵌合现象,且异常核型百分比随传代次数增加有上升的趋势。结论培养人胚胎干细胞的饲养层细胞可由无动物源性的饲养层细胞替代;长期体外培养有增加细胞染色体核型异常的风险。

刚地弓形虫RH株速殖子体外入侵小鼠巨噬细胞系感染模型的构建

目的建立刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,确定体外快速高效培养速殖子的方法。方法弓形虫RH株速殖子经昆明小鼠传代3次后,经5μm滤膜纯化计数后,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、人包皮成纤维(HFF)细胞共培养。RAW264.7细胞与虫体数量比例分别为20:1、10:1、1:1、1:5,HFF细胞与虫体比例为1:1,设无虫对照组。分别于培养后10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、32 h、48 h时间点取样,高倍镜下观察共培养情况,瑞-吉氏染色观察速殖子的黏附入侵细胞情况。将速殖子以1.5×10^(6)个/瓶接种于RAW264.7 T25细胞培养瓶中共培养,待80%假包囊破裂后,收集速殖子并计数,计算速殖子产率。用0.4%台盼蓝染液染色后,计算培养体系的活虫率。回收的弓形虫速殖子继续感染新的RAW264.7细胞,将每代细胞中收集的速殖子以1×10^(6)个/只接种5只健康雌性昆明小鼠,同时以等量的第3代速殖子接种5只健康雌性昆明小鼠作为对照,记录每代小鼠的存活时间。应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。结果当RAW264.7细胞与虫体比例大于10:1时,共培养24 h时可见细胞边界不清,胞质增加,出现大量小泡;共培养30 h时细胞大量死亡消失,未观察到游离弓形虫;当细胞与虫体比例小于或等于1:1时,共培养24 h时内胞质可见细密小颗粒,未见小泡;共培养30 h时假包囊破裂达90%以上,大量速殖子被释放至培养液中,可观察到速殖子体外发育的完整过程。速殖子与RAW264.7细胞以1:1的比例共培养0.5~1 h,约80%的速殖子侵入细胞,虫体可进入胞质和胞核,2~4 h后假包囊开始形成,8 h可见菊花状假包囊;24 h后假包囊开始破裂,32 h后细胞悬浮不贴壁,大部分假包囊破裂并释放出游离速殖子,虫体形态好,每瓶收获弓形虫速殖子6×10^(8)个,平均活虫率在92%以上。速殖子与HFF细胞共培养,2~4 h虫体基本入侵细胞;8 h后速殖子开始分裂增殖;共培养24 h,可见速殖子分裂成菊花状;36 h后细胞开始涨破,释放出的速殖子开始新一轮入侵HFF细胞。体外培养各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为3.94~4.10 d,经与昆明小鼠体内传代复毒虫株相比毒力未见减弱。结论采用小鼠巨噬细胞RAW264.7可在体外培养快速获得大量弓形虫RH株速殖子,产率为体内培养方法的400倍,且虫体毒力与体内培养方法相当,培养时间和产率上也均优于HFF细胞系。