胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立

目的探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法。方法利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定最佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐(VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞。通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达。结果以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达;小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率。结论在GFP所指示的最佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs。

国人不同年龄正常男性包皮成纤维细胞雄激素受体的测定

为确定国人不同年龄男性靶细胞雄激素受体（ＡＲ）的含量及其正常值，我们以氚标记的人工合成的雄激素－［３Ｈ］－Ｒ１８８１为配体，采用完整细胞的Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析及单点分析法测定了４０例不同年龄正常男性（从１．５－６０岁）包皮成纤维细胞的ＡＲ含量。实验表明，青春前期、青春期、青壮年期及中年期组的ＡＲ含量（位点／细胞）分别为５９４３±９０２（ｎ＝８）、６２０７±１０９７（ｎ＝１２）、６００４±１２２７（ｎ＝１２）、６３２０±１０８７（ｎ＝８）。组间比较无统计学上的差异，表明该细胞的ＡＲ含量没有与年龄相关的变化。由于本实验所用的外阴部皮肤成纤维细胞为体外培养的细胞系，故其ＡＲ的测定值只代表该细胞ＡＲ的基础值，而不反映ＡＲ在体内的调节性变化。

用包皮成纤维细胞培养弓形虫速殖子的研究

目的 建立用包皮成纤维细胞 (Humanforeskinfibroblasts ,HFF)培养弓形虫速殖子的方法。 方法 将包皮环切术切下的包皮在含青、链霉素的Hank’s液中充分洗涤后 ,用眼科剪子剪成 0 .5cm3 的组织小块 ,移入培养瓶中培养 ,待HFF细胞长满瓶底后 ,用胰酶消化并将其接种到培养皿中的盖玻片上培养 ,HFF长满盖玻片后 ,用弓形虫速殖子感染HFF ,镜下观察并于 1、2 .5、4、5 .5、10、2 3和 3 2h取出其中一皿中的盖玻片 ,经姬氏染色、二甲苯透明后 ,镜下观察速殖子生长情况。 结果 弓形虫速殖子大多在感染后 3h～ 5h侵入HFF ,3 2h左右 ,假包囊破裂 ,释放出虫体。 结论 成功建立了用HFF培养弓形虫的方法。

两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较

目的:作为理想的种子细胞,成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method,ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method,EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF),以探讨两种方法的优缺点。方法:ITCM是将剪碎的皮肤组织置0.1%Ⅱ型胶原酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15 min,待组织块贴壁于培养皿后进行培养。EDM是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,将真皮组织再次于4℃下用0.1%Ⅱ型胶原酶消化过夜,然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压,用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网,对得到的细胞悬液进行培养。ITCM与EDM均采用两种酶进行消化,但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同,最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。本研究利用ITCM和EDM分离、培养HFF,观察ITCM组和EDM组HFF的原代至第3代(Passage 0~Passage 3,P0~P3)的细胞形态;染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度;绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。采取120 mJ/cm^(2)的中波紫外线(medium-wave ultraviolet,UVB)照射P3 ITCM组和EDM组HFF,建立光损伤模型。根据有无照射紫外线,实验分为UVB组和未照射对照组(Control)。采取二次离心法提取贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),用含不同浓度(0,2.5%,5.0%及10.0%)PPP的完全培养基对ITCM组和EDM组的HFF进行分组培养,加入PPP 24 h后用CCK-8试剂盒检测损伤细胞的增殖情况。结果:ITCM组培养至第3天时可观察到大量HFF,受杂质影响小;EDM组HFF形态的观察受到较多杂质影响;第9天时,两组细胞均可传代;两种方法体外分离培养的HFF均呈长梭形、旋涡状生长。HFF培养至P2时ITCM组和EDM组波形蛋白的阳性率比较差异有统计学意义[(97.36±0.76)%vs(99.4±0.56)%,P<0.01],CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(70.8±0.46)%vs(78.37±0.75)%,P<0.01],pan-keratin的表达分别为阳性和阴性。HFF培养至P3时ITCM组与EDM组比较,波形蛋白和角蛋白染色结果差异无统计学意义(均P>0.05),CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(74.73±1.37)%vs(85.27±2.63)%,P<0.001]。EDM组P3 HFF的增殖能力显著高于ITCM组(P<0.05)。经UVB(120 mJ/cm^(2))照射后,两种方法获取的HFF出现光损伤改变;2.5%PPP组修复损伤细胞的能力显著高于其余浓度组(P<0.05或P<0.001)。结论:与ITCM法比较,EDM法获得的HFF具有纯化速度快、增殖能力强的优点;PPP对HFF的紫外线损伤具有修复作用。实验结果可为后续临床治疗研究提供理论依据。

包皮成纤维细胞的生物学特性研究

目的：探讨人包皮成纤维细胞的生物学特性，为人胚胎生殖细胞（Human embryonic germ cells．hEG cell）长期体外培养打下基础。方法：探索分离包皮成纤维细胞的方法；采用免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术等对人包皮成纤维细胞进行生长形态观察，纯度鉴定，生长曲线及细胞周期检测，并就不同浓度丝裂霉素作用不同时间对人包皮成纤维细胞生长的影响进行研究。结果：0．25％胰酶，4℃消化过夜（12～16h）较37℃，5％CO2孵育2h更容易分离表皮和真皮；包皮成纤维细胞波形蛋白染色呈强阳性，纯度达95％以上；细胞生长曲线没有明显的滞留期，在1-6d处于快速增殖期，第7d开始处于平台期；细胞周期大多数处于Go／G，期，细胞周期与细胞生长曲线保持一致。丝裂霉素抑制包皮成纤维细胞增殖的适宜浓度及时间为12．5ug／ml作用2．5h。结论：包皮成纤维细胞的生物学特性表明其可以作为人EG细胞长期体外培养的饲养层。

人孤雌胚胎干细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状态

人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)体外培养常需饲养层的支持以保持干细胞特性.通过原代培养获得人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,hFFs)并将其制备成饲养层,使hPESCs在hFFs上进行体外培养及传代.倒置显微镜下观察hPESCs的生长状态,采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)检测、核型分析和体内分化实验研究hPESCs的生物学特性及分化潜能,以探索hFFs能否长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.经原代培养成功获得了hFFs,通过形态学观察和免疫细胞化学染色鉴定符合成纤维细胞的生物学特性;在hFFs上生长的hPESCs克隆形态规则,不易分化;已成功在体外培养20余代,hPESCs仍能够保持基本生物学特性和正常核型,在裸鼠体内可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤.作为人源性饲养层,hFFs可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.

美罗培南挽救细胞培养中受细菌污染的人包皮成纤维细胞的研究

目的研究美罗培南挽救细菌污染的人包皮成纤维细胞(hFFs)的效果,并对成功挽救的hFFs的形状及增殖能力进行研究.方法将14批在培养中已发生细菌污染的hFFs随机分为美罗培南组和双抗组,分别用美罗培南法和双抗法对发生细菌污染的hFFs进行挽救.倒置显微镜下观察获得挽救的hFFs的细胞形态,测定细胞生长曲线.结果美罗培南组成功挽救了6批受细菌污染的hFFs,双抗组仅成功挽救了1批细胞.挽救成功的hFFs的细胞形态和增殖能力无明显改变.结论美罗培南可以有效消除hFFs的细菌污染,对hFFs细胞形态和增殖特性没有影响,为珍贵细胞污染提供了参考.

对数生长与G_0期人包皮成纤维细胞Stat1对INF-α刺激反应的差异

Stat1 (信号转导与转录活化子 1 )的激活与刺激因子和细胞组织类型有关 ,它的活化受体有组织分布特异性 .本研究比较 G0 期和对数生长周期两个不同状态体外培养的人包皮成纤维细胞受到干扰素 ( INF-α)刺激后 Stat1基因 m RNA、蛋白质表达以及蛋白质合成效率的差异 .结果表明 :成对数生长的细胞 Stat1的m RNA表达量较对照组增加达 1 0倍左右 ,蛋白质表达增加 3～ 4倍左右 ;G0 期细胞 Stat1的 m RNA表达量较对照组增加约 3～ 4倍 ,蛋白质表达增加约 3～ 4倍 ;对数生长细胞 Stat1蛋白质合成效率明显降低 ,在翻译水平可能有调控 .以上结果提示对数生长和 Go 细胞对

重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶促进包皮环切术后切口愈合的疗效观察

目的:探讨重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶对于包皮环切术后切口愈合的影响。方法:将342例拟行包皮环切术的患者随机分成两组。观察组172例,手术完成后给予重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶均匀涂抹切口,以后每日换药时涂抹;对照组170例,不给予重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶。观察术后两组切口平均愈合时间、切口平整率。结果:2组患者切口愈合时间和切口平整率有显著性差异(P<0.05),观察组疗效优于对照组。结论:重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶可以加快包皮手术切口的愈合,抑制瘢痕增生,值得临床推广。

包皮成纤维细胞作为饲养层对人胚胎生殖细胞生长的影响

目的以人包皮成纤维细胞为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞,观察饲养层对其生长的影响,并对人胚胎生殖细胞进行鉴定。方法分离培养4～5岁小儿包皮成纤维细胞,取P3～P30代细胞用丝裂霉素灭活后铺板备用,酶联免疫吸附测定(ELISA)-双抗夹心法检测其分泌物成纤维细胞生长因子(FGF)的含量;分离培养5～11周人胚胎原始生殖细胞,在不添加任何细胞因子的人包皮成纤维细胞饲养层上培养人胚胎生殖细胞;细胞化学法检测人胚胎生殖细胞碱性磷酸酶的活性,免疫细胞化学法检测其胚胎表面特异性抗原SSEA-1及SSEA-4的表达,RT-PCR法检测Oct-4的表达。结果包皮成纤维细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;P3～P30代包皮成纤维细胞上清液中FGF含量在(172.09±2.66)pg/L～(245.25±1.66)pg/L之间波动。分离培养的人胚胎生殖细胞在饲养层上可形成典型的胚胎生殖细胞集落,体外连续培养超过3代,其碱性磷酸酶活性呈强阳性,集落未分化标志检测显示SSEA-l、SSEA-4呈阳性,Oct-4表达阳性。结论用人包皮成纤维细胞作为饲养层能支持人胚胎生殖细胞的生长并维持未分化状态。

体外培养成人包皮成纤维细胞周期同步化效果检测

供体细胞和受体胞质周期协调性是核移植胚胎发育的关键,对人成体细胞的细胞周期分布及其同步化效果进行探讨,将为人治疗性克隆研究打下基础。结果发现:80%￣85%汇合生长成人包皮成纤维细胞G0/G1期细胞比例显著高于接种后第1天指数生长细胞及接种后第5天100%汇合生长细胞两组(67.0%vs58.2%,52.8%,P<0.05),指数生长状态下,仍有58.2%的成人包皮成纤维细胞处于G0/G1期;以0.2μg/ml和2μg/ml不同浓度阿菲迪霉素(aphidicolin,APD)处理成人包皮成纤维细胞24h,2μg/mlAPD组G0/G1期细胞比例显著高于0.2μg/ml组和对照组(10%FBS)(82.9%vs68.8%,63.5%,P<0.05),2μg/mlAPD可有效的将成人包皮成纤维细胞同步于G0/G1期,且培养液中添加10%、0.5%、0%FBS不同浓度血清对2μg/mlAPDG0/G1期同步化效果无显著影响(82.6%vs81.8%vs74.6%,P>0.05);以血清饥饿培养法(0.5%FBS)进行成人包皮成纤维细胞同步化处理,血清饥饿处理3d组G0/G1期细胞比例显著高于0d组(对照组)(71.8%vs59.6%,P<0.05),血清饥饿培养3d可有效将细胞同步于G0/G1期。因此,2μg/mlAPD处理24h和血清饥饿培养3d可有效将成人包皮成纤维细胞同步于G0/G1期。

脐带血血浆对包皮成纤维细胞生长影响的实验研究

目的探讨人脐带血血浆(HUP)能否维持人包皮成纤维细胞(HFF)的生长。方法将脐血浆经盐析、透析等处理后,按10%体积成分培养HFF,并与同样浓度的胎牛血清(FBS)进行比较,观察细胞的贴壁速度、生长曲线、细胞周期及增殖能力。结果 HFF在含10%HUP的培养液中能长期生长,其生长生长形态、细胞增殖能力及特征都与在含同体积FBS的培养液中无显著差异。结论人HUP能维持HFF的长期生长。

喷苯扎氯铵溶液和外用重组人酸性成纤维细胞生长因子小儿包皮环切术后的应用

目的:分析小儿包皮环切术后采取喷苯扎氯铵溶液和外用重组人酸性成纤维细胞生长因子的治疗效果。方法:研究对象为2020.5—2021.5月在我院收治的80例包皮环切术患儿,通过随机数字表法将其分为对照组(40例)和观察组(40例),对照组术后采取复方多粘菌素B治疗,观察组采用喷苯扎氯铵溶液和外用重组人酸性成纤维细胞生长因子治疗。比较两组患儿治疗效果、术后并发症和临床满意度等情况。结果:观察组治疗有效率高于对照组(P<0.05)。比较两组并发症发生率,观察组低于对照组(P<0.05)。比较两组家长治疗满意度,观察组高于对照组(P<0.05)。结论:小儿包皮环切术后应用喷苯扎氯铵溶液和外用重组人酸性成纤维细胞生长因子治疗效果确切,有助于促进患儿恢复,减少并发症发生风险,提高患儿家长的满意度。

中药增骨Ⅰ号对体外成纤维细胞的影响

为了探讨增骨Ⅰ 号的作用机制 ,进行了体外成纤维细胞的实验。采用酶消化法将人包皮组织进行成纤维细胞的分离 ,纯化及培养 ,并测定骨钙素、细胞钙含量。结果显示成纤维细胞在增骨Ⅰ 号组增殖迅速 ,其OD值明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,但反映成骨表型表达的骨钙素及细胞钙含量未见明显增加。表明增骨 Ⅰ 号仅有激活成纤维细胞的作用 ,本实验结果为序贯疗法应用增骨 Ⅰ 号作为骨重建中的激活药物提供了理论依据。

草莓叶水提物对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原及分泌骨形态发生蛋白-1的影响

草莓叶水提物(water extractions from strawberry leaves,SLWE)富含多种生物活性成分,能促进成纤维细胞(fibroblasts,FB)合成胶原蛋白,而胶原蛋白只有经过骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP-1)的剪切才能变成有活性的蛋白。该文通过对SLWE主成分分析及主要酶活力测定,同时探究SLWE对人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1)合成胶原蛋白I(collagen I,COL I)及分泌BMP-1的影响。结果表明:SLWE中维生素C、原花青素、多糖、总黄酮、总酚、蛋白质的含量分别为(0.88±0.025)、(0.28±0.027)、(10.00±0.278)、(1.47±0.052)、(2.05±0.031)、(0.10±0.003)mg/mL;超氧化物歧化酶、过氧化物酶的酶活力分别为125.59、0.06 U/mL;SLWE对HFF-1细胞增殖作用不明显,但具有促进其COL I表达和增加BMP-1分泌量的作用。实验结果表明SLWE含有丰富的活性成分,具有促进HFF-1中COL I分泌和成熟的作用,且此功效并非通过增加细胞数量而实现的。综上所述,SLWE具备作为延缓衰老化妆品的功效成分的潜能,为草莓叶等废弃物资源再利用提供了理论依据。

成纤维细胞生长因子受体2在尿道下裂患儿包皮组织中的表达

尿道下裂是人类泌尿生殖系统常见的先天性疾病，近年来有明显的上升趋势。但是尿道下裂确切的发病机制仍不清楚。目前研究最多的是内分泌激素的调控和其相关的基因突变，但对尿道上皮生长发育相关的因素研究很少。相关报道表明：成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor2，FGFR2）参与了尿道上皮的生长发育，FG—FR2和尿道上皮生长、发育相关，FGFR2的功能研究有助于揭示尿道下裂发生的机制。

miR-17对人包皮成纤维细胞衰老的影响

目的探讨miR-17对人包皮成纤维细胞(HFF)衰老的影响。方法 miR-17重组慢病毒感染细胞,qRT-PCR确定感染效率,CCK-8法观察miR-17对细胞增殖的影响,衰老相关β-半乳糖苷酶染色观察miR-17对细胞衰老的影响,流式细胞法检测miR-17对细胞周期的影响,Western blotting检测cyclin D1和p21蛋白的表达。结果成功分离得到HFF,并建立了稳定表达miR-17的HFF-miR-17细胞系。且HFF-miR-17细胞增殖能力明显升高,β-半乳糖苷酶染色阳性率降低;S期细胞群比例明显增高,细胞周期蛋白cyclin D1表达显著上调,p21蛋白明显下调。结论 miR-17可通过上调cyclin D1蛋白、下调p21蛋白促进原代细胞的增殖,抑制原代细胞的衰老。

人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞体外培养弓形虫速殖子

目的 比较弓形虫RH株速殖子在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内的增殖情况. 方法 按照弓形虫速殖子∶细胞为1∶1的比例将弓形虫RH株速殖子分别与人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞共培养0、6、12、24、48 h后,于显微镜下观察细胞内虫体增殖情况.在两种细胞培养瓶中分别接种弓形虫RH速殖子,连续传代,每隔10代取弓形虫速殖子,将其密度调整为1×10^7个/ml,0.3 ml/只,腹腔接种ICR健康小鼠,记录小鼠存活时间. 结果 在相同条件下弓形虫速殖子侵入人巨噬细胞的时间早于侵入人包皮成纤维细胞的时间;共培养48 h时,绝大部分弓形虫速殖子胀破细胞,游离在细胞外.在两种细胞培养瓶中分别接种3×106弓形虫RH速殖子,约72 h后均可获得大量游离的弓形虫速殖子,2～3d传1代.人巨噬细胞内连续传代约30次,每代可获得（1×10^7～4×10^7）个速殖子,约增殖3～13倍;人包皮成纤维细胞中连续传代30次,每代可获得（1×10^7～3×10^7）个速殖子,约增殖3～10倍.弓形虫速殖子传代次数为10、20和30代时,人巨噬细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.3±0.5）、（4.0±0.8）、（4.3±1.2）d,人包皮成纤维细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.0±0.0）、（3.7±0.9）、（4.3±0.5）d,各代之间差异无统计学意义（P＞0.05）,弓形虫速殖子毒力未见明显改变. 结论 弓形虫RH株速殖子可在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内增殖并长期稳定传代.

pSG5-pp71基因重组质粒在HFF中的表达与纯化鉴定

目的通过鉴定pSG5-pp71基因重组质粒,观察pp71基因在人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达,并对其进行纯化和鉴定。方法在HFF培养的基础上,通过分子克隆技术对重组质粒进行筛选,再应用基因工程技术对其纯化鉴定。结果pSG5-pp71基因重组质粒在HFF中得到高效表达。结论pp71基因能在HFF中稳定表达,为下一步抗HCMV pp71人源化基因工程抗体库的建立、筛选奠定了基础。