乌索酸诱导人单核细胞白血病细胞株THP-1分化的研究

乌索酸是一种常见的五环三萜类化合物,本文考察了其对原单核白血病细胞株THP-1的分化诱导作用。乌索酸作用72h后,通过显微镜形态观察,部分THP-1细胞贴壁生长,形态具有向巨噬细胞分化的特征。结晶紫染色结果显示细胞贴壁程度呈剂量依赖型增长。利用流式细胞分析技术分化标志物,发现CD11b和CD14阳性细胞百分比均有显著上调。Western blotting结果表明乌索酸能上调分化相关蛋白C/EBPα的p42亚基并且下调分化负调控因子c-myc的蛋白水平,且对二者的表达调控作用具有浓度和时间相关性。因此,乌索酸能够诱导THP-1细胞向单核/巨噬细胞方向分化。其作用机制可能是上调C/EBPα的p42亚基,进而下调c-myc,从而达到分化诱导作用。

氧化低密度脂蛋白致损人单核细胞白血病细胞株源性巨噬细胞Notch信号的表达

目的研究氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)致损人单核细胞白血病细胞株(THP1)源巨噬细胞Notch信号的表达,探讨Notch信号各成分对动脉粥样硬化(AS)发病的可能作用。方法用不同浓度的ox-LDL刺激THP1源巨噬细胞,在不同时间分别应用实时定量聚合酶链式反应及蛋白免疫印迹检测Notch信号通路受体配体的差异表达。结果与对照组比较,加入ox-LDL后,THP1源巨噬细胞四种受体中Notch1表达明显升高(P<0.05),五种配体中DlL4和Jagged1表达明显升高(P<0.05);Notch1、DlL4和Jagged1升高的作用在ox-LDL浓度为50 mg/L 6 h点作用最强。结论 ox-LDL致损THP1源巨噬细胞参与AS的发生与Notch1,DlL4和Jagged1高表达有关。

长链非编码RNA DLX6-AS1调控喉癌细胞的机制研究

目的分析长链非编码RNA(lncRNA)DLX6-AS1通过调节miR-144诱导喉癌巨噬细胞M2极化对喉癌细胞的影响。方法从健康志愿者中分离外周血单核细胞PBMCs,从喉癌患者中分离肿瘤相关巨噬细胞TAMs,qRT-PCR检测PBMCs和TAMs中白细胞介素10(IL-10)、精氨酸酶1(Arg-1)、lncRNA DLX6-AS1与miR-144的表达。用白细胞介素4(IL-4)诱导人单核细胞白血病细胞THP-1巨噬细胞M2极化,qRT-PCR检测lncRNA DLX6-AS1、IL-10和Arg-1与CD163表达。下调lncRNA DLX6-AS1在Hep-2细胞中的表达量后,Hep-2细胞与THP-1细胞(M2型巨噬细胞)共培养48 h,CCK-8实验检测Hep-2细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭数目,Western blot实验检测细胞上皮间质转化能力。生物信息学软件miRcode预测lncRNA DLX6-AS1与miR-144的结合位点,并进行双荧光素酶活性检测。过表达lncRNA DLX6-AS1与miR-144后,分别用CCK-8、Transwell和Western blot检测Hep-2细胞增殖、侵袭和上皮间质转化能力。结果与PBMCs相比,TAMs中IL-10和Arg-1的mRNA表达明显升高(P<0.01),lncRNA DLX6-AS1表达显著升高(P<0.01),miR-144表达显著降低(P<0.01)。与Control组相比,IL-4组THP-1巨噬细胞IL-10、Arg-1和CD163表达显著上调(P<0.01);与IL-4+si-NC组相比,IL-4+si-DLX6-AS1组THP-1巨噬细胞IL-10、Arg-1和CD163表达则显著下调(P<0.01)。与IL-4+si-NC组相比,IL-4+si-DLX6-AS1组Hep-2细胞活力显著下降(P<0.01),侵袭数目明显减少(P<0.01),N-cadherin表达显著下调(P<0.01),E-cadherin表达显著上调(P<0.01)。生物信息学分析发现,lncRNA DLX6-AS1与miR-144之间存在潜在的结合位点;双荧光素酶报告系统检测显示,lncRNA DLX6-AS1与miR-144之间存在直接相互作用。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比,pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC组THP-1巨噬细胞内IL-10、Arg-1和CD163表达显著上调(P<0.01);与pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics组相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics组THP-1巨噬细胞内IL-10、Arg-1和CD163表达显著上调(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics组相比,pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics组Hep-2细胞活力及细胞侵袭数目显著增加(P<0.01),N-cadherin表达显著上调(P<0.01),E-cadherin表达显著下调(P<0.01)。结论lncRNA DLX6-AS1可通过调节miR-144诱导喉癌巨噬细胞M2极化,并促进喉癌细胞发展。

人单核细胞白血病细胞系SHI-1的诱导分化和凋亡

目的对该实验室建立的一株新的人单核细胞白血病细胞系SHI-1进行诱导分化和凋亡的研究。方法以瑞特染色、四唑氮蓝还原试验(NBT)、流式细胞仪(FCM)检测AnnexinV以及CD11b和CD14表达的改变后和DNA凝胶电泳等方法观察三丁酸甘油酯(TB)作用后SHI-1细胞的改变;以瑞特染色、FCM检测AnnexinV以及CD11b和CD14表达的改变等方法观察三氧化二砷(As2O3)作用后SHI-1细胞的改变。结果SHI-1细胞经TB处理后,可出现典型的凋亡形态学改变,部分细胞出现部分分化,NBT实验显示还原率上升,FCM结果示CD11b的表达无改变,而CD14的表达上调,AnnexinV的检测结果显示SHI-1细胞经TB作用24h后凋亡率明显上升,可见典型的DNA梯带。SHI-1细胞经As2O3作用后可见典型的凋亡形态学改变,部分细胞可见部分分化的改变,SHI-1细胞CD14的表达上调,CD11b的表达无改变,FCM检测AnnexinV显示凋亡率明显上升。TPA作用24h后SHI-1细胞基本贴壁,形态不规则,有伪足形成。结论TB对SHI-1细胞具有诱导分化和凋亡的双向调节作用。TPA可诱导SHI-1细胞分化和贴壁。0.5μmol/L、1.0μmol/L和2.0μmol/LAs2O3可诱导SHI-1细胞发生凋亡和部分分化。

乙型肝炎病毒抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)与巨噬细胞上模式识别受体(PRR)的相互作用。方法以不同载量HBV刺激佛波酯(PMA)诱导的单核源巨噬细胞,实时定量PCR检测刺激2、4、12及24h后巨噬细胞Toll样受体3(TLR3)、黑色素瘤分化相关基因5(Mda-5)、视黄酸诱导基因I(RIG-I)表达;以poly I:C刺激与HBV共培养12h的巨噬细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定poly I:C刺激4h后培养上清液中β干扰素(IFNβ-)的分泌水平。结果不同病毒载量组巨噬细胞TLR3表达在2、4、12、24h较对照组下调,且高病毒载量组表达低于低病毒载量组(F值分别为123.64、24.50、6.69、7.61,P均<0.01);Mda-5和RIG-I在上述4个时间点的表达为高病毒载量组低于低病毒载量组(F值分别为36.44、48.58、46.59、12.77;67.68、74.54、18.18、17.76;P均<0.01)。IFNβ-的表达为:阳性对照组>低病毒载量组>高病毒载量组>阴性对照组(F=78.42,P<0.01),表达量分别为(497.2±43.7)、(294.2±48.4)、(92.5±12.3)、(40.4±9.9)pg/mL。结论 HBV能抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达,致IFN-β分泌下降,可能是其逃逸机体天然免疫的机制之一。

LPS诱导下THP-1细胞基因表达内参基因的筛选

动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）是心脑血管疾病的主要病理基础，引起AS的病因很复杂。巨噬细胞在其发生、发展过程中有重要作用^[1,2]。抑制巨噬细胞的炎症反应有可能成为预防和治疗AS的一个重要的方向。已知人单核白血病（THP-1）细胞具有单核细胞和巨噬细胞的功能和生理学特性，被广泛用于毒理学、免疫学和动脉粥样硬化等研究领域^[3]。而G-细菌细胞膜的主要成分脂多糖（1ipop01ysaccharide，LPS）可以刺激单核巨噬细胞系统发生免疫反应^[4]。明确LPS刺激THP-1细胞的基因转录水平将有助于揭示AS的病因。

短链脂肪酸对THP-1细胞和COPD小鼠炎症反应的影响

目的探讨短链脂肪酸在人单核细胞白血病(THP-1)细胞和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中的抗炎作用及意义。方法采用qRT-PCR、ELISA、Western blotting、HE染色、天狼星染色实验方法检测短链脂肪酸处理前、后的THP-1细胞和COPD小鼠炎症因子变化。结果ELISA和qRT-PCR检测结果表明,COPD患者血清中炎症因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达和浓度高于健康人群;THP-1细胞系在LPS刺激后这些炎症因子高表达,经过短链脂肪酸处理后,丁酸盐比乙酸盐和丙酸盐能更好降低这些炎症因子的表达。在COPD小鼠饮水中加入丁酸盐后,通过qRT-PCR和ELISA检测发现,小鼠肺组织炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达降低,外周血炎症因子IL-6和IL-1β浓度降低,但TNF-α浓度并无统计学差异;Western blotting检测蛋白结果表明,转录因子kappa B(NF-κB)磷酸化表达降低,丁酸盐可能通过抑制NF-κB信号通路而抑制炎症因子的表达。结论短链脂肪酸中的丁酸盐能够抑制由LPS诱导的THP-1细胞炎症反应,并对COPD小鼠的炎症起到一定抑制作用。

乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4的激活

目的研究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在乙型肝炎病毒(HBV)逃逸机体天然免疫中的作用。方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)诱导人单核细胞白血病细胞(THP)-1分化成巨噬样细胞,并与HBsAg共培养作比较,在脂多糖(LPS,TLR4的配体)和Pam3CSK4(TLR1、2的配体)的刺激下,检测细胞上清液中细胞因子白细胞介素10(IL-10)、IL-12的表达及胞内IL-10、IL-12mRNA的含量,并利用免疫荧光法观察核转录因子-kappaB(NF-κB)p65入核和蛋白质印迹法(Western blot)检测IκB-α蛋白降解与胞外信号调节激酶(ERK)蛋白磷酸化水平来判定TLR信号通路活化程度。结果HBsAg的胞外处理能以剂量依赖的方式干扰Pam3CSK4和LPS诱导的IL-10和IL-12的产生,同时HBsAg的存在明显干扰Pam3CSK4和LPS诱导的NF-κB p65入核和IκB-α降解以及ERK蛋白磷酸化水平。结论HBsAg抑制TLR2和TLR4的激活。

630 nm LED红光照射后THP-1来源M0巨噬细胞的蛋白质组学分析

目的分析630 nm发光二极管(light emitting diode,LED)产生红光照射对人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源M0巨噬细胞的作用与机制。方法用佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)处理THP-1细胞,制备THP-1来源M0巨噬细胞,并使用强度为28.8 J/cm^(2)的630 nm LED红光照射M0巨噬细胞,随后采用非标定量蛋白质组学分析方法筛选差异表达蛋白并进行基因本体论(gene ontology,GO)注释和富集;通过string在线网站(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape软件分析蛋白质互作情况,根据关键蛋白的作用,分析630 nm LED红光照射与THP-1来源M0巨噬细胞的关系。结果蛋白质组学结果显示,630 nm LED红光照射THP-1来源M0巨噬细胞后,62个差异表达蛋白能够显著富集在细胞对刺激反应、线粒体膜电势负性调控和平滑肌细胞增殖的调控等相关生物学进程。在显著性排名前10的生物学进程中,细胞对刺激反应相关生物学进程占70%,主要为对糖刺激反应(4个进程)、对神经生长因子反应(2个进程)等;进一步分析细胞应对刺激相关生物学进程中涉及的8个蛋白间蛋白互作情况结果显示,转录因子叉头箱蛋白O3亚基(forkhead box O3,FOXO3)、炎症相关蛋白前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)或称环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和炎症因子白介素-18(interleukin-18,IL-18)为关键互作蛋白,并且在630 nm LED红光照射后的THP-1来源M0巨噬细胞中,FOXO3和IL-18的蛋白水平显著升高(P<0.05),PTGS2(COX-2)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论630 nm LED红光照射对THP-1来源M0巨噬细胞的作用,类似于糖和神经生长因子对细胞的刺激反应;通过上调THP-1来源M0巨噬细胞中FOXO3蛋白的表达抑制M0巨噬细胞中PTGS2(COX-2)介导的炎症状态。

miR-485-5p通过靶向白介素-1受体关联激酶4调控巨噬细胞炎症反应

目的探究miR-485-5p对白介素-1受体关联激酶4(IRAK-4)的靶向作用,研究其在巨噬细胞模型炎症反应中的调控作用。方法合成miR-485-5p模拟物(mimics)及其抑制剂(inhibitors),分别转染HEK-293T细胞,RT-PCR检测miR-485-5p的表达水平。根据miRNA靶向作用预测数据分析选定IRAK-4作为研究的靶基因,构建IRAK-43'UTR及其突变体萤火虫-海肾双荧光素酶报告基因系统,通过检测在细胞模型中过表达/抑制表达miR-485-5p后对荧光素酶活力的影响,验证miR-485-5p与IRAK-4之间的靶向关系,Westernblot检测IRAK-4蛋白质表达水平。构建巨噬细胞模型,将miR-485-5pmimics及inhibitors分别转染巨噬细胞,RT-PCR检测靶基因IRAK-4mRNA的表达水平,ELISA检测上清中下游致病因子IL-6、IL-17、IL-18的表达。结果通过实验证实miR-485-5p与IRAK-4存在靶向作用。细胞模型中,与对照组相比,转染miR-485-5pmimics后miR-485-5p表达水平升高了17.15倍(P<0.01),转染miR-485-5pinhibitors后miR-485-5p表达水平降低了79.80%(P<0.05)。过表达miR-485-5p后明显抑制IRAK-4的蛋白水平表达及mRNA相对含量,抑制下游炎性因子IL-6、IL-17、IL-18的表达(P<0.05);抑制表达miR-485-5p,则上调IRAK-4的蛋白水平及mRNA相对含量,可显著提高IL-6、IL-17、IL-18的释放(P<0.05)。结论证实miR-485-5p可以通过对靶向IRAK-4的特异性序列,调控下游炎性细胞因子的表达,进而调控细胞的炎症反应。

重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的机制研究

目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对人单核细胞白血病细胞（THP-1）的损伤机制及其钙离子通道的研究。方法采用倒置显微镜、CCK-8法、Fluo3/AM法、caspase 活性检测等方法测定rVvhA对THP-1细胞的影响，并研究胞外Ca2＋的内流途径。结果 rVvhA作用后细胞形态学变化明显，细胞皱缩、变形甚至裂解，且呈剂量依赖性。12μg/ml rVvhA 作用THP-1细胞1 h后胞外K＋浓度升高，作用6 h后胞外LDH浓度显著升高。 Verapamil、Mibefradil和SKF-96365均不能抑制rVvhA引起的Ca2＋内流。同时rVvhA可导致THP-1细胞的caspase-3和caspase-9活性升高，并呈时间依赖性。结论 rVvhA对THP-1细胞具有明显的损伤作用，且可能通过caspase-9/3途径诱导细胞凋亡，并能引起细胞内Ca2＋浓度升高，升高的Ca2＋可能通过细胞膜上形成的孔道被动入胞。

钙离子对重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的影响机制

目的研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1）的凋亡机制及其Ca2＋的变化。方法采用CCK-8法、激光共聚焦显微镜结合Fluo3／AM法、流式细胞术结合AnnexinV-PI标记等检测rVvhA对THP-1细胞的影响，并观察胞内Ca2＋浓度变化。结果rVvhA可诱导THP-1细胞发生凋亡并引起细胞内ca2＋浓度升高，细胞内钙离子螯合剂BAPTA—AM处理组胞内钙离子升高幅度远高于细胞外钙离子螯合剂EGTA处理组。结论rVvhA具有诱导THP-1细胞凋亡的生物学活性，并能引起细胞内ca2＋浓度升高，升高的Ca2＋主要源于胞外钙离子内流。