人单纯疱疹病毒-2型感染致豚鼠输卵管上皮细胞凋亡的研究

目的探讨人单纯疱疹病毒-2型感染导致输卵管妊娠的机制。方法培养豚鼠原代输卵管上皮细胞,用人单纯疱疹病毒-2型感染,显微镜下观察输卵管上皮细胞的形态学变化,并用Western blot法检测细胞凋亡关键蛋白caspase-3的变化。结果豚鼠原代输卵管上皮细胞被人单纯疱疹病毒-2型感染后,显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征,Western blot检测发现细胞凋亡关键蛋白caspase-3活化成两个亚基。结论人单纯疱疹病毒-2型感染后引起豚鼠输卵管上皮细胞凋亡,人单纯疱疹病毒-2型感染引起输卵管上皮细胞凋亡是输卵管妊娠的机制之一。

单纯疱疹病毒2型ICP27_(377-513)核酸疫苗联合IL-15核酸疫苗免疫效果的观察

目的构建表达单纯疱疹病毒2型感染细胞蛋白27(infected cells protein 27,ICP27)的重组质粒pcDNA3.1-ICP27377-513并观察白细胞介素(IL)-15核酸疫苗联合HSV-2-ICP27377-513核酸疫苗的免疫效果。方法采用分子克隆技术构建pcDNA3.1-ICP27377-513重组质粒。将BALB/c雌性小鼠随机分为pcDNA3.1-ICP27377-513联合pcDNA3.1-IL-15(pIL-15)组、pcDNA3.1-ICP27377-513组、pcDNA3.1组和pIL-15组,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后28 d取血,用微量中和实验法检测血清中特异性中和抗体,ELISA法检测血清中IL-4、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)水平。阴道给予致死量HSV-2攻击小鼠,分别于接种后3 d、7 d和14 d收集阴道冲洗液,用荧光定量PCR法检测生殖道病毒载量。结果pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组中和抗体效价分别为40.00±8.16、28.67±4.47,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组IFN-γ、IL-4水平明显高于pcDNA3.1-ICP27377-513组(P<0.05),但IL-2水平两组间差异无统计学意义(P>0.05)。阴道给予致死量HSV-2攻击后,pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组小鼠阴道冲洗液中病毒载量随着时间延长逐渐减低,pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-15核酸疫苗联合HSV-2-ICP27377-513核酸疫苗对小鼠有较好的免疫保护作用。

乙酰紫草素体外抗2型单纯疱疹病毒机理的研究

目的研究乙酰紫草素(acetylshikonin,AS)体外抗2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2,HSV-2)的活性及作用机理。方法以阿昔洛韦(acyclovir,ACV)为阳性对照药物,采用CCK-8法检测细胞活力,确定AS对成年非洲绿猴肾细胞(Vero)的最大无毒浓度;致细胞病变法和噬斑形成抑制实验测定AS对HSV-2的抗病毒活性;实时荧光定量PCR及半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)法测定病毒载量以评估AS对HSV-2复制周期不同阶段的抑制作用;透射电镜观察AS对HSV-2病毒粒子结构的影响。结果AS对Vero细胞的最大无毒浓度(maximal atoxic concentration,TC0)为3.785μmol/L,浓度为1.678~3.785μmol/L时能有效抑制HSV-2复制,减少噬斑形成,半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)为0.334μmol/L。在12和36 h,病毒释放期加入AS的实验组TCID50低于病毒感染对照组(13.43±10.04 vs.127.00±0.32;3.47±0.55 vs.5.80±0.12),差异均有统计学意义(t=8.359、4.161,P均<0.05);在12、24、36 h,AS直接灭活病毒组病毒载量低于病毒感染对照组(0.24±0.09 vs.1.35±0.07;4.46±0.06 vs.6.75±0.04;2.70±0.04 vs.5.27±0.10),差异均有统计学意义(t=9.920、33.360、24.020,P均<0.05)。此外,AS处理可导致HSV-2病毒粒子形态异常,随着AS浓度升高,作用后的HSV-2超微结构发生渐进改变。结论AS对HSV-2具有一定抗病毒效应,其机理可能为直接破坏病毒颗粒完整结构发挥抗病毒作用。

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

Ⅱ型单纯疱疹病毒培养及gG-2基因特异片段的克隆

目的:通过培养和扩增Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)并提取其全基因组,从而克隆包膜糖蛋白gG-2全长基因及其保守性较高、抗原性较强的特异片段。方法:将HSV-2病毒感染Hela细胞获得大量病毒液,用酚-氯仿法提取病毒全长基因组,并以此为模板扩增编码gG-2的US4基因,再根据氨基酸序列比对结果,选取其特异片段,设计带酶切位点的引物克隆gG-2基因特异片段。结果:成功地获得了大量HSV-2病毒液并提取了病毒基因组,克隆了gG-2全长基因以及特异片段,测序证实,两者均与GenBank中报道的序列相一致。结论:对于遗传特性相对稳定的HSV-2来说,通过病毒感染细胞的方法短时期内获得大量病毒液,并从病毒全基因组中克隆gG-2特异基因片段的方法是可行的,从而为进一步构建gG-2特异片段相关载体、表达相应蛋白奠定了基础。

I型单纯疱疹病毒感染对人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和黏着斑激酶表达的影响

背景研究表明，I型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染可导致角膜上皮细胞（CECs）基质金属蛋白酶（MMPs）表达、分泌和活性改变。黏着斑激酶（FAK）对MMPs的表达、释放和激活起着重要的调节作用。人角膜上皮感染HSV-1后FAK的表达变化鲜有报道。目的探讨HSV-1感染对体外培养的人CECsMMP-2和FAK表达的影响。方法以HSV-1（F株）感染体外培养的人CECs，应用逆转录PCR（RT—PCR）、免疫印迹法、免疫组织化学法分别于感染后2、20、40h检测人CECsMMP-2、FAK及磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）的表达情况。结果RT．PCR法检测结果显示，感染细胞的MMP-2mRNA、FAKmRNA较非感染细胞（即加入无病毒无血清培养液的阴性对照组）的表达明显增强，不同时间点间比较差异无统计学意义，组别与时间点间不存在交互作用（MMP-2mRNA：F目目=0．968，P=0．436；F蚴I=47．649，P=0．000；F女Ⅱ#目=0．757，P=0．536．FAKmRNA：F时间=0．658，P=0．631；F组别=35．182，P=0．000；F交互作用=1．386，P=0．137）。Westernblot法检测结果显示，感染后2h时p-FAK、FAK、MMP-2在感染细胞与非感染细胞间差异均无统计学意义（P’0．05），感染后20h、40h感染细胞的蛋白表达较非感染细胞均明显增强（P〈0．05）。免疫组织化学染色检测结果显示，随着感染时间的延长，MMP-2、FAK、p-FAK蛋白染色阳性细胞数目增多。结论在HSV-1感染早期，FAK的激活可刺激MMPs活性增强，从而加速角膜溃疡及坏死性病变的形成。

感染2型单纯疱疹病毒对人宫颈上皮细胞自噬活性及IFN-β、IL-6表达的影响

目的探讨2型单纯疱疹病毒(HSV-2)对人宫颈上皮细胞HCE自噬及干扰素β(IFN-β)、IL-6表达的影响。方法将体外培养的人宫颈上皮细胞HCE分为观察组和对照组,观察组用Vero细胞病毒接种HSV-2,对照组正常培养不进行处理。收集对照组和观察组感染HSV-2后1、4、11、18、22 h的细胞,采用免疫荧光法(FITC)检测各组细胞荧光强度,采用Western blotting法检测各组细胞LC3Ⅱ表达量;收集对照组和观察组感染HSV-2后1、4、11、18、22 h的细胞,采用ELISA法检测上清液IFN-β、IL-6。结果感染HSV-2后观察组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量及上清液IL-6、IFN-β水平迅速升高,与对照组相比,P均<0.05。至感染后4 h观察组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量及上清液IL-6、IFN-β水平均达到峰值,然后缓慢下降。结论感染HSV-2可以提高人宫颈上皮细胞自噬活性及IFN-β、IL-6表达,且感染早期效果较强。

脑脊液二代测序诊断成人单纯疱疹病毒-2型脑炎一例

本例患者通过脑脊液二代测序技术明确诊断为单纯疱疹病毒-2型脑炎,并给予阿昔洛韦及地塞米松治疗后,患者痊愈出院.单纯疱疹病毒-2型脑炎在临床上罕见,且颅内感染的病原学诊断率较低,通过脑脊液二代测序技术可检出可能的致病原,为后续的目标性治疗提供依据.

2型单纯疱疹病毒对HaCaT细胞分泌IL-17和IL-23mRNA的影响

目的:检测2型单纯疱疹病毒(HSV-2)感染后HaCaT细胞分泌IL-17、IL-23 mRNA的水平变化,明确IL-17和IL-23与角质形成细胞(KC)是否参与了HSV-2病毒感染初期的免疫防御机制。方法:用HSV-2病毒感染HaCaT细胞,采用荧光实时定量PCR检测感染后24 h、48 h、72 h及空白对照组IL-17、IL-23 mRNA的表达。结果:HSV-2病毒感染后72 h HaCaT细胞分泌IL-17 mRNA的表达量低于对照组,而IL-23 mRNA表达量高于对照组(P<0.05)。结论:在HSV-2感染KC初期,IL-17和IL-23可能参与早期免疫防御反应。

单纯疱疹病毒2型对鼠抗原呈递细胞分泌IL-6影响的研究

目的探讨单纯疱疹病毒2型(HSV2)对鼠抗原呈递细胞(DC2.4、RAW264.7株)分泌白介素6(IL6)的影响及意义。方法用HSV2感染和/或脂多糖刺激DC2.4、RAW264.7株,ELISA法测定IL6分泌水平的变化。结果HSV2感染能促进两种细胞IL6的分泌,不能抑制脂多糖刺激细胞后IL6的分泌。结论HSV2感染促进DC2.4、RAW264.7细胞分泌IL6,使免疫反应趋向于Th2型免疫应答,可能为HSV2感染发生免疫逃避的机制之一。

LAMP技术检测单纯疱疹病毒-2型的初步应用

目的建立一种对单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)进行快速、高效、简便的LAMP检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-2基因组DNA,设计4条扩增HSV-2糖蛋白gG基因的LAMP引物,以灭菌水为阴性对照,进行LAMP,LAMP产物经电泳、酶切鉴定。将HSV-2 DNA作10倍系列稀释后进行LAMP,检测其敏感性。结果HSV-2 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增条带。LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实。LAMP检测HSV-2的敏感性为0.01 ng/μL。结论检测HSV-2的LAMP方法特异、敏感、简便。

贻贝黏蛋白体外抗单纯疱疹病毒-2型的作用

目的探讨贻贝黏蛋白(MAP)体外抗单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)的作用。方法采用细胞病变效应(CPE)观察细胞形态结合MTT法检测MAP对Vero细胞形态的影响和毒性。通过CPE检测MAP对HSV-2的直接影响以及对病毒感染的抑制作用。结果细胞毒性试验结果显示,MAP在125μg/ml及以下浓度对Vero细胞形态和活性无明显影响。MAP对HSV-2活性具有直接影响作用,其半数有效浓度(EC 50)为54.88μg/ml,与溶媒对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。MAP对HSV-2感染后引起的细胞病变效应亦有一定的抑制作用,其EC 50在125μg/ml以上,与溶媒对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论MAP对HSV-2感染具有一定的抑制作用,提示其在抗HSV活性方面具有进一步研究的潜力。

3262名孕妇单纯疱疹病毒-Ⅱ型近期感染的监测

目的:为了解孕妇单纯疱疹病毒-型(HSV-型)近期感染状况。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对3262名孕妇静脉血标本进行了HSV--IgM检测。结果:在上述3262名孕妇中检测出HSV--IgM阳性标本41例,阳性率为1.26%。结论:孕妇单纯疱诊病毒-型近期感染应引起临床医师关注。

探究2型单纯疱疹病毒(HSV-2)对人永生化角质形成细胞株(HaCaT)分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响

目的:分析2型单纯疱疹病毒对人永生化角质形成细胞株分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响,为临床探讨角质形成细胞对2型单纯疱疹病毒感染初期的免疫防御机制提供依据。方法:应用2型单纯疱疹病毒感染人永生化角质形成细胞,并对感染后24、48、72h的IL-19、IL-20mRNA(信使RNA)的表达量使用荧光实时定量PCR进行检测,分析HSV-2对HaCaT细胞分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响。结果:实验组HSV-2对HaCaT细胞分泌IL-19、IL-20mRNA表达量显著高于对照组,P<0.05。结论:角质形成细胞经2型单纯疱疹病毒感染后可分泌IL-19、IL-20,并参与2型单纯疱疹病毒感染初期的免疫防御反应。

2型单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表达及其对Ve-ro细胞活性的影响

目的:在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)毒力蛋白感染细胞多肽34.5(ICP34.5),并检测其对Vero细胞活性的影响。方法:PCR扩增HSV-2的ICP34.5基因,连接至pEGFP-C2载体,并对重组真核表达载体pEGFP-ICP34.5进行双酶切测序验证;将重组子瞬时转染Vero细胞,RT-PCR检测其在mRNA水平的表达,荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达,MTT法检测细胞活性。结果:经双酶切和测序验证表明pEGFP-ICP34.5构建成功,转染细胞后经RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜下观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达,MTT法检测结果证实重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用。结论:构建了pEGFP-ICP34.5真核表达载体,其能在Vero细胞中高效表达,并能抵消空质粒对细胞的损伤作用。

更昔洛韦眼用凝胶联合干扰素α-2b治疗上皮型单纯疱疹病毒性角膜炎的疗效观察

目的探讨使用更昔洛韦眼用凝胶+干扰素α-2b治疗上皮型单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)的效果。方法选取我院2018年2月至2019年2月收治的70例上皮型HSK患者为研究对象,随机分为两组各35例。对照组单用更昔洛韦眼用凝胶治疗,观察组在对照组基础上加用重组人干扰素α-2b滴眼液治疗。比较两组的治疗效果,治疗前后视力,治疗期间不良反应,以及疾病复发情况。结果观察组的治疗总有效率为97.14%,显著高于对照组的80.00%(P<0.05)。治疗2周与4周后,两组的视力均较治疗前提高,且观察组的视力均显著高于对照组(P<0.05)。观察组的不良反应发生率、随访复发率分别为2.86%、0.00%,均显著低于对照组的17.14%、11.43%(P<0.05)。结论更昔洛韦眼用凝胶联合干扰素α-2b治疗上皮型HSK的效果显著,可显著提高视力,且患者治疗期间的不良反应发生率及随访复发率均较低。

余甘子提取物体外抗单纯疱疹病毒1型和2型的初步研究

目的从余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物3种提取物体外筛选抗单纯疱疹病毒1型和2型的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、空斑减数法,判断药物的毒性及其抗病毒效应。结果余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对于单纯疱疹病毒1型的半数抑制浓度分别为25.28,66.17,100.94μg/ml;余甘子的3种提取物对于单纯疱疹病毒2型的半数抑制浓度分别为31.70,180.3,112.1μg/ml。结论余甘子3种提取物在体外对单纯疱疹病毒1型和2型均有一定的抑制作用。

白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答

目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果。方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达。动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺入法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变。结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降。在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果。结论IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果。

小檗碱衍生物HB-13抗单纯疱疹病毒-2作用机制的研究

目的探讨小檗碱衍生物HB-13抗单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的作用机制。方法采用细胞病变法检测HB-13是否对HSV-2有直接作用;空斑法检测HB-13是否抑制HSV-2的吸附和释放;荧光定量PCR检测HB-13是否影响HSV-2 DNA复制以及蛋白免疫印迹方法检测HB-13是否影响HSV-2蛋白质合成。结果HB-13在细胞外无直接杀灭HSV-2作用;对HSV-2的吸附和释放亦无影响;不抑制HSV-2 DNA复制;但HB-13浓度依赖性地抑制HSV-2蛋白质合成。结论HB-13可抑制HSV-2蛋白质合成,其抗HSV-2作用机制与ACV等核苷类药物不同。

阿昔洛韦治疗单纯疱疹病毒Ⅰ型脑炎小鼠血清一氧化氮、白细胞介素-1β水平变化及病理学观察

目的探讨阿昔洛韦治疗单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠血一氧化氮(NO)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平变化及病理学改变。方法建立单纯疱疹病毒-1(HSV-1)感染的小鼠病毒性脑炎模型,将模型分为未治疗和阿昔洛韦治疗组,同时设正常对照组,比较各组小鼠病死率、血清NO、IL-1β水平变化和电镜下小鼠神经细胞形态结构变化。结果模型组小鼠脑组织HSV-1DNA均为阳性,正常对照组为阴性;电镜下模型组神经细胞内可见HSV-1病毒颗粒;阿昔洛韦治疗组小鼠死亡率、血清NO及IL-1β水平均比未治疗组明显降低,差异有显著性(Pa<0.01);电镜下阿昔洛韦治疗组小鼠神经细胞,髓鞘病变均较轻。结论阿昔洛韦可能通过降低单纯疱珍病毒Ⅰ型脑炎小鼠血清NO、IL-Iβ水平,减轻神经细胞的炎症反应及细胞因子引起的神经毒性作用,达到对神经细胞的保护作用。