雷公藤甲素对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞细胞凋亡及氧化应激的影响

目的:探究不同浓度雷公藤甲素(TP)对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。方法:将32只SPF级雌性SD大鼠随机分为4组,即空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,每组8只。TP低、中、高剂量组分别给予60、120、240μg/kg TP腹腔注射,连续14 d。称量大鼠体质量、卵巢湿重并计算卵巢指数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平。苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织形态学,生化试剂盒检测卵巢组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量,二氢乙啶(DHE)染色法检测卵巢组织活性氧(ROS)水平,Western blotting检测芳香化酶(CYP19A1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cle-caspase-3)、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达情况。细胞实验分为空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,TP低、中、高剂量组人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)分别用20、40、60nmol/L TP处理。采用CCK8法检测细胞活力,ELISA检测细胞上清E2,显微镜观察明场细胞形态,TUNEL染色法检测DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针检测细胞ROS水平,Western blotting检测CYP19A1、Bcl-2、Bax、Cle-caspase-3、Nrf2、HO-1蛋白表达情况。结果:动物实验,与空白组比较,TP中、高剂量组大鼠体质量、卵巢指数明显降低,血清E2和P水平降低,FSH和LH水平升高,闭锁卵泡增多、发育卵泡减少,卵巢组织SOD、CAT酶活力下降,MDA含量增加,卵巢组织ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞实验,与空白组比较,TP处理组KGN细胞活力明显下降,TP中、高剂量组细胞上清E2含量减少,细胞明显出现皱缩、变圆、体积变小等现象,TUNEL阳性表达细胞数增加,细胞凋亡率明显增加,细胞ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:TP能引起显著的卵巢毒性,作用机制可能与氧化应激和细胞凋亡有关。

棕榈酸对人卵巢颗粒细胞脂质代谢和自噬的影响

目的探讨棕榈酸对人卵巢颗粒细胞KGN细胞株自噬和脂质代谢的影响及其机制。方法以不同浓度棕榈酸单独或联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理刺激KGN细胞,油红O染色实验检测细胞脂质沉积;细胞增殖试剂盒(CCK-8)法测定KGN细胞的活性;DCFH-DA荧光探针标记法检测细胞活性氧(ROS)含量;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)表达水平、微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)、泛素结合蛋白p62、PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)、Parkin表达水平。结果在0~400μmol·L^(-1)范围内,随着棕榈酸浓度上升,细胞内脂滴数量增多,SREBP1表达量增加,细胞活性显著下降(P<0.05)。与对照组比较,400μmol·L^(-1)棕榈酸处理组细胞内ROS含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高(P<0.05),p62、PINK1、Parkin蛋白相对表达量上调(P<0.05)。使用自噬抑制剂3-MA预处理后,3-MA+棕榈酸处理组较400μmol·L^(-1)棕榈酸处理组细胞活性升高(P<0.05),ROS含量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05),p62、PINK1、Parkin蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论棕榈酸对卵巢颗粒细胞具有脂毒性,可能通过PINK1/Parkin途经激活卵巢颗粒细胞自噬,并可被3-MA逆转。

美洲大蠊小肽预处理对H_(2)O_(2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激及凋亡的抑制作用

目的探讨不同浓度美洲大蠊小肽预处理对H_(2)O_(2)诱导人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)氧化应激及凋亡的影响。方法取对数生长期的KGN细胞,分为空白组、H_(2)O_(2)组和美洲大蠊小肽50、100、150组。各组均常规培养24 h,空白组不予特殊处理,H_(2)O_(2)组加入250μmol/L H_(2)O_(2)作用6 h;美洲大蠊小肽50、100、150组分别加入50、100、150μg/mL美洲大蠊小肽进行预处理,然后加入250μmol/L H_(2)O_(2)作用6 h。采用CCK-8法检测空白组、H_(2)O_(2)组和美洲大蠊小肽50、100、150组分别预处理6、12、24 h的细胞存活率,并比较各组(美洲大蠊小肽50、100、150组均预处理12 h)细胞活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)表达。结果H_(2)O_(2)组细胞存活率低于空白组(P<0.05)。预处理6 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率与H_(2)O_(2)组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率均高于H_(2)O_(2)组(P均<0.05)。与预处理6 h比较,美洲大蠊小肽50、100、150组预处理12、24 h的细胞存活率均升高(P均<0.05);预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组细胞MDA、NO、ROS表达均升高(P均<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,美洲大蠊小肽50、100、150组细胞MDA、NO、ROS表达均降低(P均<0.05),美洲大蠊小肽50、100、150组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论美洲大蠊小肽预处理能够减轻H_(2)O_(2)诱导的KGN细胞氧化应激及凋亡,以50μg/mL作用12 h为最佳预处理条件。

人卵巢颗粒细胞上胰岛素/胰岛素样生长因子受体表达的相关性研究

目的研究人卵巢颗粒细胞胰岛素受体(insulin receptor,INSR)和胰岛素样生长因子-1受体(insulinlike growth factor 1 receptor,IGF-1R)的表达及相关性。方法接受体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)不孕症患者84例,按照妊娠结果分为妊娠组和未妊娠组,每组42例。应用实时荧光定量PCR(realtime PCR)法测定取排卵日成熟卵泡壁颗粒细胞INSR,IGF-1R mRNA的表达;并对INSR,IGF-1R mRNA之间及与血清LH、E2、P水平相关性分析。结果妊娠组血清雌二醇水平高于未妊娠组(P<0.05)。妊娠组优质胚胎数高于未妊娠组(P<0.05)。其余两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。妊娠组INSR、IGF-1R、表达高于未妊娠组(P<0.05)。INSR与IGF-1R呈正相关(r=0.712,P<0.01)。结论颗粒细胞INSR、IGF-1R可能参与卵母细胞质量的调节。

过氧化氢诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立

目的探讨构建过氧化氢(H_2O_2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的方法。方法不同浓度H_2O_2处理人卵巢颗粒细胞COV434,采用Western blot检测Caspase-3表达,流式细胞仪和DAPI/TUNEL双染色法检测细胞凋亡情况,H2DCF-DA检测细胞内活性氧族(ROS)水平,通过量效关系和时效关系来确定H_2O_2的最佳作用条件。结果 1~1.5 mmol/L浓度H_2O_2处理COV434细胞2~4h后Caspase-3表达量升高最明显。随着H_2O_2浓度增加及作用时间的延长细胞凋亡率不断升高。细胞内ROS水平随着H_2O_2浓度的增加而增加。1.5mmol/L浓度H_2O_2处理1h后细胞内ROS水平上升最明显。结论 H_2O_2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的最适宜浓度为1~1.5 mmol/L,采用细胞凋亡情况评价作用时间是2~4h,采用ROS评价作用时间为1h。

核受体激动剂对人卵巢颗粒细胞和乳腺癌MCF-7细胞芳香化酶的调节作用

目的 :探讨各种核受体包括过氧化酶体增生物激活受体 γ(PPARγ)和 α(PPARα)、维甲酸受体 (RAR)、维甲类 X受体 (RXR)、维生素 D受体 (VDR)、甲状腺素受体 (TR)和糖皮质激素受体 (GR)的激动剂对人卵巢颗粒细胞和乳腺癌 MCF- 7细胞芳香化酶活性的调节作用。 方法 :测定人卵巢颗粒细胞和 MCF- 7细胞在上述各种核受体激动剂处理前后芳香化酶活性的变化和细胞色素 P4 5 0芳香化酶 (P4 5 0 arom) m RNA的表达水平。结果 :(1) PPARγ和 RXR激动剂均能显著抑制人卵巢颗粒细胞芳香化酶活性 ,两者结合使用抑制作用更进一步增强 ,并且伴有 P4 5 0 arom m RNA水平下降 ;(2 ) RAR和 RXR激动剂合用能显著刺激乳腺癌 MCF- 7细胞芳香化酶活性 ,并使 P4 5 0 arom m RNA表达水平升高。 结论 :人卵巢颗粒细胞和乳腺癌MCF-

补肾活血法复方解除雷公藤甲素抑制人卵巢颗粒细胞分泌功能的研究

目的探讨雷公藤甲素对体外培养人卵巢颗粒细胞增殖的影响及补肾活血中药复方对此影响的解除作用。方法 MTT法检测雷公藤甲素6种不同浓度对人卵巢颗粒细胞原代培养细胞增殖的影响,并计算出细胞半数抑制浓度值(IC50);放免法分别检测颗粒细胞正常组(正常组)、雷公藤甲素抑制组(TL组)、中药含药血清组(TL+中药组)的雌二醇(E2)、孕酮(P)水平。结果雷公藤甲素浓度≥1μg/m L时对人卵巢颗粒细胞的增殖有明显抑制作用,且呈剂量依耐性;当IC50为5.33μg/m L时,TL组的E2、P水平明显低于正常组(P均<0.05),而TL+中药组E2、P水平均明显高于TL组(P均<0.05)。结论雷公藤甲素能抑制体外培养的人卵巢颗粒细胞的分泌功能,补肾活血中药复方能解除其抑制作用,提高体外培养的人卵巢颗粒细胞的分泌功能。

不同分离方法对人卵巢颗粒细胞体外培养的影响

目的比较人卵巢颗粒细胞不同分离方法。方法取体外受精-胚胎移植(IVF-ET)采卵时的卵泡液,用裂解法、密度梯度离心法、酶解法分离纯化并原代培养人卵巢颗粒细胞。比较不同的分离方法获得的卵巢颗粒细胞数量、形态及其对早期培养的影响。结果裂解法得到的颗粒细胞数较密度梯度离心法、酶解法多(P<0.005,P<0.001);比较3种分离方法获得的卵巢颗粒细胞的活性和孕激素分泌量差异无统计学意义;接种24 h后,酶解法得到的卵巢颗粒细胞存活量最多(P<0.05),裂解法得到的存活细胞最少(P<0.05);裂解法获得的卵巢颗粒细胞继续培养48、72及96 h均较培养24 h有明显细胞增殖(P<0.05),且与其他组存活的细胞量差异无统计学意义。结论裂解法得到的颗粒细胞数量多,细胞生长较好,操作简单,是较理想的分离人卵巢颗粒细胞的方法。

人卵巢颗粒细胞的体外分离培养方法改进

目的建立高效稳定的人卵巢颗粒细胞的体外分离培养方法。方法收集体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液,查阅近几年文献中人卵巢颗粒细胞的分离纯化方法,对沉淀法和梯度密度离心法进行改进,用改进了的沉淀法和密度梯度离心法相结合对卵巢颗粒细胞进行分离纯化,选择合适的消化时间,简化分离纯化步骤从而减少对颗粒细胞的损伤。结果分离出的人卵巢颗粒细胞生长状态良好,存活率高,收获的细胞数量多,后续生长稳定。结论建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础。

人卵巢颗粒细胞体外分离培养后连续传代的观察

目的观察两种方法分离的人卵巢颗粒细胞(GCs)体外培养后的连续传代情况。方法选取行辅助生殖技术治疗的不孕患者,收集促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液(FF),分别用密度梯度离心法和红细胞裂解法分离人GCs,进行体外培养、扩增及连续传代,并用免疫荧光法对原代及传代后GCs进行鉴定。结果红细胞裂解法获得的GCs数量较密度梯度离心法显著增多(P<0.05),密度梯度离心法分离的GCs的24 h贴壁率显著高于红细胞裂解法(P<0.05)。两种方法分离的GCs均在7 d出现短梭形改变,10 d左右开始退化。两种方法分离的原代GCs在第3~5天为快速增殖期,第7天细胞增殖达到顶峰,第10天左右细胞量下降,每个时间点密度梯度离心法处理的细胞量均显著高于红细胞裂解法(P<0.05);传代后细胞1~5 d为快速增殖期,7 d左右达顶峰,10 d左右下降,各时间点两种分离方法所获GCs传代培养的细胞量均无统计学差异(P>0.05)。两种方法分离的GCs均可进行连续传代,细胞形态无明显差异,且连续传代后的GCs仍表达卵泡刺激素受体(FSHR)。结论密度梯度离心法较红细胞裂解法可获得生长情况更为良好的原代GCs;两种分离方法所获GCs均可体外连续传代。

雌孕激素对人卵巢颗粒细胞瘦素受体表达的影响

目的通过人卵巢黄素化颗粒细胞体外培养,观察雌、孕激素对其瘦素受体蛋白表达的调控作用。方法行体外受精-胚胎移植患者经阴道超声引导下取卵时留取卵泡液,分离颗粒细胞体外培养,培养至第3天加入不同浓度的17-β雌二醇或孕酮,继续培养2d,采用免疫细胞化学方法将颗粒细胞进行荧光标记,经流式细胞式检测其瘦素受体蛋白表达阳性细胞百分率。结果流式细胞仪检测发现所检测各浓度17-β雌二醇、孕酮均能增强颗粒细胞瘦素受体蛋白的表达,17-β雌二醇作用高峰浓度为1μg/ml,孕酮作用高峰浓度为1ng/ml。结论雌孕激素在体外可增强人卵巢黄素化颗粒细胞瘦素受体蛋白的表达,提示瘦素可能参与卵巢功能的调节,为深入研究瘦素在卵巢中的作用提供理论依据。

人卵巢颗粒细胞分离培养的优化及生物学特性

目的:建立原代人卵巢颗粒细胞(hGCs)的分离培养方法,观察其生物学特性。方法:取卵日,收集hGCs,分为对照组(DMEM培养基)和实验组(DMEM培养基∶卵泡液=1∶1)进行培养。比较2组hGCs的生长状态和雌激素分泌情况。利用RT-qPCR检测Nanog、Oct4、Sox2的表达,应用流式细胞术检测CD44、CD73、CD45的表达。结果:hGCs培养24 h贴壁良好,细胞间伸出伪足。对照组和实验组分别在培养14 d和21 d后出现凋亡。实验组雌激素的分泌显著增加,第9天出现高峰,第21天显著下降。培养第7天实验组Oct4和Nanog mRNA表达显著增加。培养7 d后,CD44、CD73表达阳性, CD45表达阴性。结论:该方法简单、有效,可获得大量hGCs。培养基中添加卵泡液有益于hGCs的生长,增加培养天数。同时hGCs可分泌雌激素并具有一定的干细胞特性。

二甲双胍对IFN-γ诱导的人卵巢颗粒细胞损伤的保护作用

目的:探讨二甲双胍对干扰素(interferon,IFN)-γ诱导的人卵巢颗粒细胞KGN功能损伤的效应及可能机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍单独及与IFN-γ共处理对KGN细胞活力的影响,并观察细胞生长状态的变化;流式细胞术检测不同处理对KGN细胞凋亡及周期的影响;q-PCR法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)mRNA的表达。结果:IFN-γ可抑制KGN细胞活力、阻滞细胞从G0-G1期进入S期,并促进凋亡(P <0.05);二甲双胍单独处理几乎不影响KGN细胞功能;但二甲双胍与IFN-γ共同作用可提高损伤的KGN细胞活力,缓解IFN-γ引起的细胞凋亡及周期阻滞,并抑制细胞周期负性调节蛋白CDKN1A表达的异常上调。结论:二甲双胍可减轻IFN-γ诱导的KGN细胞功能损伤,并且可能是通过下调细胞周期负性调节蛋白CDKN1A的异常表达发挥保护作用。

胰岛素样生长因子2通过磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路调控人卵巢颗粒细胞增殖的机制

目的检测胰岛素样生长因子2(IGF2)对人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)增殖的调控作用及作用机制。方法将体外培养的KGN细胞,分不同浓度IGF2处理组(对照组和25μg/L、50μg/L、100μg/L IGF2组)和磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路干预组(以LY294002干预处理将细胞分对照组、100μg/L IGF2组、LY294002组和IGF2+LY294002组)。采用MTS和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(Ed U)法检测IGF2对KGN细胞增殖的影响,ELISA法检测细胞培养液上清中雌激素、孕激素的含量,Western blotting法检测各组胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)及CYP19A1蛋白表达。结果随着IGF2的浓度梯度增高,KGN细胞的增殖率及雌激素、孕激素的分泌量逐渐升高,以100μg/L IGF2处理组的细胞增殖率和激素水平最高(P<0.01),而抑制PI3K/Akt信号通路,细胞增殖率和激素的分泌量均明显降低(P<0.01);Western blotting结果显示,IGF1R、p-Akt及CYP19A1蛋白表达水平随着IGF2的浓度梯度逐渐升高(P<0.05),而干预PI3K/Akt信号通路可影响上述蛋白的表达,与对照组相比,IGF2组和IGF2+LY294002组IGF1R及p-Akt蛋白表达均明显升高(P<0.01),CYP19A1在IGF2组明显升高(P<0.01),LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白明显降低(P<0.05),IGF1R的表达差异无统计学意义。与IGF2组相比,IGF2+LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白表达降低(P<0.01),IGF1R的表达差异无统计学意义,LY294002组p-Akt及CYP19A1蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。结论IGF2可能由IGF1R介导通过PI3K/Akt信号通路促进人卵巢颗粒细胞的增殖及分泌功能。

PPARγ和RXR激动剂抑制人卵巢颗粒细胞芳香化酶活性和其mRNA的水平

目的 探讨过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和维甲类X受体 (RXR)激动剂对人卵巢颗粒细胞芳香化酶活性的调节作用。方法 测定人卵巢颗粒细胞 (KGN)在PPARγ激动剂曲格列酮、吡格列酮和前列腺素J2 以及RXR激动剂LG10 0 2 68处理前后芳香化酶活性、雌酮 (E1)的变化以及P45 0芳香化酶 (P45 0arom)mRNA的表达水平。对P45 0arom启动子Ⅱ进行分析 ,以确定PPARγ和RXR是否直接抑制P45 0arommRNA的转录。结果 (1)PPARγ激动剂和RXR激动剂均能显著抑制芳香化酶活性 ,两者结合使用抑制作用进一步增强并且使E1的生成减少 ;(2 )芳香化酶活性的降低与P45 0arommRNA水平下降有关 ;(3 )PPARγ和RXR激动剂对 1.0kb长的P45 0arom启动子Ⅱ控制的荧光素酶蛋白无调节作用。结论 PPARγ和RXR激动剂对人卵巢颗粒细胞的芳香化酶活性和P45 0arommRNA的水平有抑制作用。

MAPKs和Nrf2/ARE通路调控卵巢颗粒细胞氧化应激的机制研究

目的运用过氧化氢(H_2O_2)制作人卵巢颗粒细胞(COV434)氧化应激模型,通过检测氧化应激MAPKs和抗氧化应激Nrf2/ARE通路的变化,探讨COV434氧化应激的机制。方法研究不同H_2O_2浓度(0.5、1、1.5 mmol/L)和不同作用时间(1、2、4、6及12 h)梯度下,MAPKs家族中ERK、P38及JNK蛋白及其磷酸化的表达水平,Nrf2/ARE通路中Nrf2、keap1和P62蛋白表达水平。结果在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,COV434细胞内p-ERK、p-P38、p-JNK在1 h表达最强;在不同浓度H_2O_2作用4 h后,p-ERK不随浓度的变化而变化,然而p-P38、p-JNK随浓度的增加表达增强;Nrf2蛋白表达随着H_2O_2作用时间的延长和浓度的增加逐渐增强;Keap1在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,随着时间延长蛋白表达轻度下降,而P62的蛋白表达轻度上升;在不同浓度H_2O_2作用4 h下Keap1变化不明显,而P62表达稍微增强。结论 MAPKs 3个亚族均参与了H_2O_2诱导COV434氧化应激过程,氧化应激可以诱导细胞内Nrf2的蛋白表达,提示Nrf2/ARE通路在COV434自我抗氧化中发挥作用。

基于人卵巢颗粒细胞KGN建立的卵泡刺激素体外生物活性效价测定法

目的:基于哺乳动物体内激素具有刺激卵巢颗粒细胞产生黄体酮(孕酮)的机理,建立尿促性素(human menopausal gonadotropin, HMG)刺激人卵巢颗粒细胞KGN分泌孕酮(progesterone, PG)法,用于评价HMG中活性成分卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)的效价。方法:用不同浓度的HMG溶液刺激KGN细胞,检测分泌上清中的PG含量,建立FSH的体外生物学活性效价测定方法;参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则9101分析方法验证和9401生物制品生物活性/效价测定方法,验证指导原则对所建立的方法进行专属性、精密度、耐用性等方法学研究;以HMG国家标准品作为基准,检测HMG国际标准品和制剂(合格和不合格)的效价。结果:不同浓度的HMG作用KGN细胞后具有时间和剂量依赖性。结论:本方法的专属性、精密度和耐用性符合《中华人民共和国药典》四部通则的要求;以HMG国家标准品为基准,能有效检测HMG国际标准品和注射用HMG的效价,与药典方法一致。

GSK-3β抑制剂对体外培养多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞睾酮分泌过多的影响

目的探讨糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂SB216763改善多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞睾酮(T)分泌异常的作用机制。方法将行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的20例不孕妇女按发病原因分为三组,其中不孕原因为输卵管及男方因素的非PCOS患者8例为对照组,PCOS不孕患者12例平均分为PCOS组和GSK-3β抑制剂组,每组6例。对照组及PCOS组患者的卵巢颗粒细胞进行体外培养48 h,利用放射免疫法检测细胞上清液中的雌二醇(E2)、孕酮(P)、T的水平。GSK-3β抑制剂组用浓度为5、10、25、50、100μmol/L的GSK-3β抑制剂SB216763对体外培养的PCOS患者卵巢颗粒细胞进行干预,后继续培养48 h,检测细胞上清液中的E2、P、T的水平。结果 (1)PCOS组与对照组患者相比其卵巢颗粒细胞中T分泌明显升高(P<0.01),而P和E2的表达变化不大(P>0.05)。(2)GSK-3β抑制剂组PCOS患者卵巢颗粒细胞给予不同浓度的GSK-3β抑制剂SB216763作用后,与PCOS组相比,T平明显下降(P<0.05)。(3)GSK-3β抑制剂SB216763浓度为5μmol/L时对PCOS患者卵巢颗粒细胞T分泌的抑制作用最明显(P<0.01)。结论 PCOS患者卵巢颗粒细胞T分泌异常增高,GSK-3β抑制剂SB216763能够抑制其T的过多分泌。

二甲双胍对体外培养人卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

目的本研究探讨不同浓度二甲双胍在不同时间点对其分泌类固醇激素的影响。方法收集因输卵管因素不孕或者男性因素不孕行IVF/ICSI-ET患者促排卵后的含有黄素化颗粒细胞的卵泡液,经密度梯度离心后分离获得颗粒细胞,行体外培养。分别加入含有二甲双胍浓度为0 ng/ml,10 ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml的DMEM培养基对其进行体外培养,每24h收集细胞培养上清,用化学发光法检测上清液中雌二醇及孕酮的水平。结果体外培养颗粒细胞分泌类固醇激素在72h到96h达到高峰,120h后开始递减,这与二甲双胍体外生长曲线一致;二甲双胍都能够抑制类固醇激素的分泌,且二甲双胍浓度在10000ng/ml,能够极显著抑制类固醇激素的分泌,在每个时间点均呈剂量依赖性。结论二甲双胍在颗粒细胞体外发育整个过程中均抑制。

微小RNA 761对人卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

目的研究微小RNA 761(miR-761)对人卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法取多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞培养,随机分为3组,分别为miR-761 inhibitor组(转染miR-761抑制剂),miR-761 mimic组(转染miR-761模拟物),miR-NC组(转染阴性对照寡核苷酸)。用细胞计数法-8(CCK-8)实验检测转染细胞的增殖能力;用TUNEL实验检测转染细胞的凋亡能力;用蛋白质印迹(Western blot)法检测雌激素受体2(estrogen receptor 2,ESR2)的表达。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-761与ESR2之间的结合关系。结果miR-NC组、miR-761 mimic组和miR-761 inhibitor组的细胞存活率分别为(98.33±1.53)%,(121.23±3.74)%,(79.86±3.66)%;细胞凋亡率分别为(6.51±0.26)%,(4.41±0.24)%和(10.48±0.33)%;ESR2蛋白表达水平分别为1.05±0.03,0.74±0.08和3.90±0.28。以上指标,miR-NC组和miR-761 mimic组相比,miR-NC组和miR-761 inhibitor组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-761可与ESR2靶向结合。结论miR-761通过下调ESR2促进PCOS患者卵巢颗粒细胞增殖并抑制细胞凋亡。