Myocilin Asn 450 Tyr突变促进人原代小梁网细胞中细胞外基质蛋白的表达及意义

目的研究小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因Myocilin N450Y突变(c.A1348T: p.N450Y, Myoc-N450Y)对人原代小梁网细胞(HTMC)细胞外基质(ECM)蛋白相关基因表达的影响及其参与青光眼发生发展的机制。设计实验研究。研究对象人原代小梁网细胞。方法实验分为三组,共9个样本,分别为空载体组、野生型Myoc (Myoc-WT)组及Myoc-N450Y组,用慢病毒感染的方法将Myoc-WT基因及Myoc-N450Y突变基因在HTMC中过表达,用蛋白质印迹法及荧光定量PCR方法检测Myoc-WT组和Myoc-N450Y组ECM蛋白Ⅰ型胶原蛋白(COL Ⅰ)、Ⅳ型胶原蛋白(COL Ⅳ)、纤连蛋白(FN)及基质金属蛋白酶(MMP)相关基因基质金属蛋白酶2(Mmp2)、基质金属蛋白酶9(Mmp9)的表达差异;构建野生型Myoc基因(Myoc-WT)及Asn 450 Tyr突变的Myoc基因(Myoc-N450Y)慢病毒载体,包装并确定慢病毒感染HTMC的条件;应用Myoc-WT慢病毒颗粒及Myoc-N450Y慢病毒颗粒感染HTMC,采用蛋白印迹法及荧光定量PCR方法检测Myoc基因的过表达情况及N450Y突变后对Col Ⅰ、Col Ⅳ、Fn、Mmp2、Mmp9表达的影响。主要指标 Col Ⅰ、Col Ⅳ、Fn、Mmp2、Mmp9基因的表达量。结果酶切鉴定结果及测序结果显示成功构建过表达Myoc-WT基因及Myoc-N450Y基因的慢病毒载体,并且慢病毒颗粒感染HTMC的感染复数(MOI)为5。蛋白质印迹及荧光定量PCR结果显示Myoc-WT及Myoc-N450Y组Myoc基因的蛋白水平及mRNA水平均高效过表达,空载体组、Myoc-WT组及Myoc-N450Y组Myoc基因mRNA相对表达量分别为1.00±0.11、28.88±1.28、22.06±0.47(F=1020.02,P<0.001)。荧光定量PCR结果显示,Myoc-N450Y组Col Ⅰ、Col Ⅳ及Fn基因 mRNA相对表达量分别为2.08±0.07、1.76±0.08、2.63±0.06,显著高于Myoc-WT组的0.93±0.04、0.95±0.09、0.89±0.06(P均<0.001)。且与Myoc-WT组相比,Myoc-N450Y组COL Ⅰ及FN蛋白表达水平显著上调。Myoc-N450Y组Mmp2、Mmp9 mRNA相对表达量分别为0.32±0.02和0.33±0.15,分别显著低于Myoc-WT组的1.01±0.03和0.95±0.03(P均<0.001)。结论成功制备可在HTMC过表达Myoc基因的慢病毒。过表达Myoc-N450Y基因对HTMC中ECM蛋白相关基因Col Ⅰ、Col Ⅳ及FN的表达具有促进作用,对MMP蛋白相关基因Mmp2、Mmp9的表达具有抑制作用。推测Myoc-N450Y可能通过调节ECM蛋白相关基因的表达参与青光眼的发生发展。