白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用研究

目的研究白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用机制。方法将培养的口腔黏膜上皮角质细胞分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组),另将单独培养的口腔黏膜上皮角质细胞作为阴性对照组。比较各组对口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用,并观察白色念珠菌对口腔黏膜上皮角质细胞的凋亡和增殖作用。结果菌丝组黏附指数(7.63±1.39)显著高于孢子组(3.47±1.04),差异有统计学意义(P<0.05);菌丝组凋亡率[(3.49±0.4)%]显著高于孢子组[(2.07±0.15)%]和阴性对照组[(1.98±0.07)%],差异有统计学意义(P<0.05),而孢子组和阴性对照组凋亡率相比差异无统计学意义(P>0.05)。菌丝组G0/G1期细胞比例[(38.17±7.83)%]显著低于孢子组[(49.47±11.41)%]和阴性对照组[(57.71±9.39)%],差异有统计学意义(P<0.05);S期[(8.54±4.03)%]、G2/M期[(20.18±9.59)%]细胞比例上升,且显著高于孢子组[(6.47±2.73)%、(10.71±3.19)%]和阴性对照组[(5.35±2.11)%、(12.38±4.35)%],差异有统计学意义(P<0.05);PI[(42.79±18.73)%]明显高于孢子组[(28.67±8.79)%]和阴性对照组[(26.87±7.64)%],差异有统计学意义(P<0.05),而孢子组和阴性对照组PI相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论白色念珠菌能够导致口腔黏膜上皮角质细胞发生凋亡和增殖周期改变。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响探讨

目的探讨分析白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞(HOK,human oral keratinocytes)凋亡和增殖的影响。方法选取2015年8月-2016年8月期间我院66例体检健康者颊黏膜,对HOK进行培养,于菌丝型和孢子型白色念珠菌中加入制备的HOK,并分组,前者作为菌丝组,后者作为孢子组,而对照组则为单纯HOK,通过对比研究的方式,探讨白色念珠菌对HOK产生的影响。结果菌丝组凋亡率、G_0/G_1期、S期、G_2/M期、PI与对照组、孢子组对比(P<0.05),而孢子组与对照组在凋亡率、G_0/G_1期、S期、G_2/M期、PI方面对比,差异不明显(P>0.05)。结论 HOK的增殖和凋亡与白色念珠菌有着密切关系,其能够引起HOK在调往率方面表现出升高的趋势,改变HOK增殖周期。

口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液中CYFRA21-1水平与口腔上皮癌变进程的相关性研究

目的 探讨口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液中细胞角蛋白19片段(Cytokeratin-19-fragment, CYFRA21-1)水平与口腔上皮癌变进程的相关性。方法 对口腔疾病患者102例进行回归性分析,包括舌白斑57例(白斑组),口腔鳞状细胞癌45例(鳞癌组),另选同期检查口腔黏膜正常人员44例(正常组),对比各组人员的口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液中CYFRA21-1水平,分析各指标与口腔上皮癌变进程之间的关系。结果 三组的口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液CYFRA21-1表达水平:鳞癌组>白斑组>正常组,三组对比差异具有统计学意义(P<0.05);组间两两对比差异具有统计学意义(P<0.05)。鳞癌患者中晚期组的口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液CYFRA21-1表达水平均高于早期组,两组对比差异具有统计学意义(P<0.05)。根据单因素及多因素统计分析得,分化程度、淋巴结转移情况、口腔黏膜微核细胞计数、血清CYFRA21-1、唾液CYFRA21-1均为口腔鳞状细胞癌的癌症进程独立危险因素(P<0.05)。口腔黏膜微核细胞计数、血清CYFRA21-1、唾液CYFRA21-1单项检测的敏感度分别为84.0%、72.0%、64.0%,特异度为78.9%、68.4%、73.7%;联合检测的敏感度和特异度分别为88.0%、84.2%,其中联合检测的敏感度和特异度最高,对早期鳞癌和癌前病变的诊断效能最好。结论 口腔黏膜微核细胞计数及血清、唾液CYFRA21-1与口腔鳞癌的疾病进程存在密切联系,可以帮助预测诊断早期口腔鳞癌及癌前病变。

槟榔提取物对口腔上皮细胞生物功能影响的研究

目的探讨槟榔提取物(ANE)对人口腔上皮细胞的生物学功能影响。方法本研究首先分析了梯度浓度ANE下对人口腔角质细胞(HOK)增殖的影响;采用第二代RNA测序分析对照组与ANE干预组HOK细胞的差异表达基因。随后,流式细胞术用于检测HOK细胞周期和凋亡;β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色试剂盒用于检测细胞衰老;免疫荧光实验检测HOK细胞中Ki67和γH2AX蛋白的表达;实时聚合酶链反应(RT-PCR)用于检测衰老相关表型基因白细胞介素(IL)-6、基质金属蛋白酶-2(MMP2)和TGFB1表达;免疫印迹用于检测自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62)和上皮间充质转化(EMT)相关蛋白(SMAD2、p-SMAD2、E-Cadherin和Vimentin)的表达;酶联免疫吸附实验用于检测HOK细胞外分泌蛋白TGFB1表达。结果测序结果显示ANE可引起HOK细胞细胞周期、p53、自噬、FoxO、细胞衰老等信号通路相关基因异常表达。流式细胞术显示ANE可诱导HOK细胞凋亡和G2/M期阻滞。与对照组相比,ANE处理后的HOK细胞衰老细胞数量增加,衰老相关表型基因IL-6、MMP2和TGFB1表达上调。此外,相较于对照组,ANE组中HOK细胞的γH2AX、LC3-Ⅱ、TGFB1、p-SMAD2和Vimentin蛋白表达增加,Ki67蛋白、LC3-Ⅰ和E-Cadherin蛋白表达下降。结论ANE可诱导HOK细胞凋亡、G2/M期阻滞、衰老、DNA损伤、自噬和EMT,形成促癌的细胞微环境。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用及影响因素研究

目的 研究白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞（human oral keratinocytes,HOK）的黏附作用及影响因素.方法 本研究于2012年8月至2014年3月在中国医科大学附属口腔医院中心实验室完成.体外培养白色念珠菌和HOK,在不同浓度、温度和pH值条件下,用白色念珠菌浊悬液感染HOK,并进行革兰染色,油镜下观察,计算黏附指数、黏附率.结果 在同一浓度下,菌丝相的白色念珠菌黏附率明显高于孢子相的;随着白色念珠菌浓度的升高,黏附率也有所增加.另外,白色念珠菌浓度为107 CFU/mL与HOK的细胞浓度为105个/mL时黏附基本达到饱和,可作为后续试验的最佳浓度.随着温度升高,白色念珠菌的黏附率也随之增加.黏附的最适宜pH值范围是6.0～8.O.结论 白色念珠菌黏附率的增加与菌丝的形成有关,有利于菌丝形成和生长的条件均可提高黏附率.

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响

目的:探索白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞(KB细胞)凋亡和增殖的影响。方法:分别培养孢子型白色念珠菌和菌丝型白色念珠菌,取健康志愿者的颊粘膜制备KB细胞,分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组),另外取单纯KB细胞作为对照组。对比分析各组细胞凋亡率及各个周期的细胞数,统计分析各组细胞增殖指数(PI)。结果:菌丝组凋亡率显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在G0/G1期的细胞比例均显著低于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在S期和G2/M期的细胞比例均显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组的PI显著高于孢子组和对照组(P<0.05)。结论:菌丝型白色念珠菌可诱导KB细胞凋亡率的上升及改变KB细胞周期变化,并引起KB细胞的PI升高,对于临床上治疗口腔念珠菌病具有重要的指导意义。

自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究

目的探讨自体血清培养人口腔黏膜角质细胞的可行性,为组织工程口腔黏膜用于临床提供理论和技术依据。方法应用自行制备的含10%、20%和30%自体血清的培养液及10%胎牛血清培养液,对人口腔黏膜角质细胞进行培养。对比观察不同浓度自体血清和胎牛血清培养的口腔黏膜角质细胞及上皮组织生长情况,绘制10%自体血清组及10%胎牛血清组细胞生长曲线及计算其倍增时间。并行抗-HLA免疫荧光检测培养上皮。结果各浓度自体血清组和10%胎牛血清组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组细胞倍增时间为24.02±1.80h,与10%胎牛血清组20.90±0.79h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞24h克隆形成率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);随自体血清浓度升高获得黏膜上皮面积增大,厚度增加,以20%自体血清组最为明显,与10%胎牛血清组培养黏膜上皮比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组培养上皮经抗-HLA免疫荧光检测为阳性。结论制备的自体血清能完全替代胎牛血清对口腔黏膜角质细胞进行培养,且培养的口腔黏膜上皮组织分化优于胎牛血清。

角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用研究

目的研究不同浓度角质细胞生长因子(KGF)对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用,为探讨KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据。方法将不同浓度的KGF(对照组0 ng·mL-1,实验1组5 ng·mL-1,实验2组25 ng·mL-1,实验3组50 ng·mL-1)分别加入体外培养的口腔黏膜上皮细胞,培养12、24、48 h后,倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果 1)实验组较对照组细胞贴壁明显,且48 h时实验3组细胞核仁明显。2)培养48 h时,4组之间的细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均有统计学差异,随着KGF浓度的增加,细胞凋亡率和Bax mRNA表达逐渐降低,Bcl-2 mRNA表达逐渐升高(P<0.05)。结论 KGF可通过上调Bcl-2 mRNA和下调Bax mRNA的表达抑制上皮细胞的凋亡。

基于转录组测序分析芍药苷诱导下口腔黏膜上皮细胞差异表达基因

目的:基于转录组测序分析芍药苷调控人口腔黏膜上皮细胞基因表达的情况,分析关键基因,探讨芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用机制以及其药用价值。方法:实验分为3组,空白对照组、低浓度(5μmol/L)和高浓度(10μmol/L)芍药苷组处理口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1,进行转录组测序分析,从而筛选出差异表达基因(DEGs),采用GO和KEGG富集分析对DEGs进行基因功能和途径注释。结果:芍药苷诱导下,Leuk-1细胞中共有1212个显著DEGs;GO富集分析显示,DEGs显著富集在免疫反应、体液免疫应答反应、细胞因子介导的通路反应2’-5’寡腺苷酸合成酶活性、丝氨酸内酞酶活性、细胞外空间、细胞外组分和内质网等功能中;KEGG通路富集显示,DEGs显著富集在单纯疱疹病毒Ⅰ感染、癌症通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、人类乳头瘤病毒感染等信号通路中;采用实时荧光定量PCR技术检测了参与芍药苷诱导的Leuk-1细胞差异表达的基因,其趋势域RNA-seq一致,可以验证RNA-seq技术的准确性。结论:芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用主要体现在抗病毒感染、肿瘤抑制、保护上皮完整性以及免疫调节等方面。

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的:探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法:通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养,取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞,将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率;HE染色观察细胞片层的结构;免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果:人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力,高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90,培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长,细胞克隆形成率约为2.2%,并将其构建成3~4层口腔黏膜细胞片层,且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论:人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层,为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。

口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法

目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素,并建立稳定的细胞培养体系。方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本,比较不同浓度的Dispase对上皮的分离作用,酶消化法分离细胞,采用无血清培养液进行原代和传代培养。结果微生物污染得到有效控制,0.40%的Dispase的上皮分离效果优于0.25%的Dispase,细胞在短期内快速稳定增殖。结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作,并提高成功率。

口腔黏膜上皮细胞与猪小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

目的探讨体外快速培养犬口腔黏膜上皮细胞(OMECs)及其与猪小肠黏膜下层(SIS)体外复合培养的方法,为组织工程化黏膜研究提供实验依据。方法采用混合酶消化法,于6%胎牛血清的上皮细胞无血清培养基(DKSFM)中培养OMECs,观察OMECs的形态特征、绘制生长曲线并进行细胞表面标志物检测。将第2代犬OMECs接种在SIS上,行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、扫描电镜等观察OMECs在SIS上的生长状况。结果OMECs在DKSFM中生长良好,CK19细胞角蛋白免疫组化染色阳性。OMECs接种在SIS上呈单层生长,多角形,铺路石样排列,复合培养8d呈多层生长。结论采用混合酶消化法,用含6%胎牛血清的DKSFM培养犬OMECs,方法简便,适合推广应用。SIS与OMECs有良好的相容性,可作为构建组织工程化黏膜的理想支架材料。

人口腔黏膜上皮细胞的培养

目的:培养人口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的人正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系,为进一步采用组织工程技术构建口腔黏膜组织奠定基础.方法:取3个月唇裂患儿手术多余口腔黏膜,经Dispase及胰蛋白酶消化获取细胞,采用无血清角化细胞培养液进行原代培养,并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等细胞定性研究.结果:在0.25×102个细胞的低密度接种下,经过20天培养,获得了完全融合成片的口腔黏膜原代细胞,细胞呈铺路石样生长,经鉴定为单一的口腔黏膜上皮细胞.结论:正常口腔黏膜组织经Dispase及胰蛋白酶消化,应用无血清培养液进行培养,可成功培养出人正常口腔黏膜上皮原代细胞.

口腔黏膜微核细胞数与上皮异常增生病损癌变的关系

目的:探讨微核细胞计数与上皮异常增生病损(oral epithelial dysplasia,OED)癌变的关系。方法:收集30例健康对照者口腔黏膜、46例口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)病损、78例口腔黏膜白斑(oral leukoplakia,OLK)伴上皮单纯增生病损、30例OLK伴轻度OED病损、29例OLK伴中度OED病损、15例OLK伴重度OED病损和22例口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)病损的口腔脱落细胞进行Feulgen及fast green染色,计数微核细胞数。结果:微核细胞率依OSCC、OLK伴重度OED、OLK伴中度OED、OLK伴轻度OED、OLK上皮单纯增生、OLP、健康对照者口腔黏膜的顺序逐渐降低(P<0.001)。结论:口腔黏膜微核细胞计数可反映口腔上皮癌变的进程,可作为患者定期随访的监测指标。

组织工程口腔黏膜上皮治疗角膜缘干细胞缺陷症的实验研究

目的探讨体外培养的自体组织工程口腔黏膜上皮重建兔角膜上皮的可行性。方法制作兔角膜缘干细胞缺陷模型32只,实验组Ⅰ～Ⅲ以自体口腔黏膜上皮细胞为种子细胞制作组织工程上皮,移植到实验组模型兔角膜表面,分别观察2周、1个月、3个月,对照组移植空白载体膜,观察3个月。术后裂隙灯显微镜下观察,以角膜新生血管、混浊度及上皮染色评分评价移植效果。用组织病理、免疫组织化学和印迹细胞技术评价角膜上皮重建的可能性。结果模型兔角膜混浊,有大量新生血管和杯状细胞。实验组移植后角膜透明,印迹细胞检查PAS(-)。实验组与对照组术后角膜总评分差异有统计学意义(P=0.000),p63表达阳性,角膜上皮的组织特点及角蛋白的表达与正常角膜上皮相似。结论组织工程口腔黏膜上皮在角膜基质微环境的诱导下可分化为角膜样上皮细胞,有重建角膜上皮的作用。

人口腔黏膜角化上皮细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:探讨人口腔黏膜角化上皮细胞的体外培养扩增方法及其生物学特性。方法:取牙周手术中切取的正常角化牙龈组织,经0.25％Dispase分离上皮层后,0.05％的胰酶分离为单个细胞,接种在无血清培养基中,进行原代培养及传代培养,并进行形态学观察、角蛋白免疫组化染色及其生长曲线、传代特点、各代生长特点的观察。结果:口腔黏膜角化上皮细胞能够在Epilife无血清培养基中稳定增殖传代,可连续传4-6代,成活45-60d,细胞生长呈铺路石状,角蛋白免疫组化染色阳性。结论:应用Epilife无血清培养基,可在短期内获得大量具有增殖能力的口腔黏膜角化上皮细胞。

正常和病变的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素的敏感性差异研究

目的观察正常和不同病变程度的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素(IFN-α)敏感性的差异,为IFN-α的抗肿瘤应用和机制的研究提供基础。方法分别培养正常口腔黏膜上皮细胞株(NOK)、口腔黏膜异常增生上皮细胞株(DOK)、口腔表皮样癌细胞株(KB),取传至第3代对数生长期细胞接种于细胞培养板,对照组每孔加入2 m L含10%胎牛血清的完全培养液,实验组设IFN-α浓度100、500、1 000 U/m L 3个浓度组,实验组每孔分别加入含相应浓度IFN-α的完全培养液,常规培养24 h后检测细胞增殖能力、细胞凋亡和细胞周期变化情况。结果不同浓度的IFN-α分别作用于3种细胞,对NOK细胞株的增殖能力无影响,而DOK、KB细胞株各实验组与对照组相比增殖能力明显减慢,差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。浓度500 U/m L IFN-α对NOK细胞株的凋亡无影响,但有促进DOK、KB细胞株凋亡的作用。浓度500 U/m L IFN-α对NOK细胞株周期无影响,DOK细胞株G0/G1期细胞比例显著减少,而G2/M期细胞比例显著增加,KB细胞株G2/M期细胞比例显著增加。结论正常上皮细胞对IFN-α不敏感,而DOK、KB细胞株对IFN-α敏感;IFN-α有抑制DOK、KB细胞株的增殖能力、促其凋亡的作用,且细胞周期阻滞于G2/M期。

兔口腔黏膜上皮细胞与PCL电纺纤维的复合尿道支架的制备及可行性分析

目的探讨兔口腔黏膜上皮细胞与聚己内酯(PCL)电纺纤维的复合支架用于尿道修复的可行性。方法用三氯甲烷和无水甲醇体积比5∶1的混合液配制25%PCL混合液,通过静电纺丝得到PCL纤维管状支架,在其管腔内种植1.5×105个兔口腔黏膜上皮细胞,然后埋入裸鼠皮下,2周后取出,通过HE和细胞角蛋白抗体免疫荧光染色对该复合尿道支架进行生物学评价。未种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL管为对照组,其评价方法同上。结果与对照组比较,种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL管展现出良好的细胞化,并且兔口腔黏膜上皮细胞在PCL管腔表面形成了一层致密的细胞层,兔口腔黏膜上皮细胞能够在PCL管腔表面存活增殖。结论兔口腔黏膜上皮细胞可以作为组织工程化尿道支架的种子细胞来源之一,其与PCL电纺纤维相结合,可以构建适合于尿道修复需要的组织工程替代材料。

慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

目的通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶(h TERT)基因的口腔黏膜上皮细胞(OMECs),探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应(PCR)法扩增h TERT基因全长,构建重组慢病毒载体p LVX-puro-h TERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测h TERT基因m RNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了p LVX-puro-h TERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,h TERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过慢病毒法成功建立了过表达h TERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人永生化OMECs细胞系奠定了实验基础。

hTERT诱导永生化口腔黏膜上皮细胞株的建立

目的:转染外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因建立永生化口腔黏膜上皮(oral mucosal epithelial,OME)细胞株。方法:利用反转录病毒载体将外源性hTERT基因转入OME细胞,G418筛选出抗性细胞克隆后,进行免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)鉴定细胞来源、细胞形态学观察、细胞增殖动力学研究、裸鼠成瘤实验以及hTERT基因和蛋白表达的检测。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学处理。结果:转染细胞与未转染细胞形态非常相似,均呈多边形、多角形,"铺路石"样排列;广谱角蛋白染色阳性,波丝蛋白染色阴性;未转染细胞体外培养36 d后停止生长,群体倍增数(population doublings,PDL)为9,转染细胞增殖活跃,PDL值超过80;RT-PCR和Western印迹结果均显示,hTERT在转染细胞中稳定表达,而在未转染细胞中不表达。结论:转染外源性hTERT基因的OME细胞呈稳定增殖的永生化状态。