miR-192-5p在增生性瘢痕组织及成纤维细胞中的表达及调控

背景:研究表明,miRNAs的表达与肝纤维化、肾纤维化及皮肤纤维化发生有关;并证实在痛风性关节炎中miR-192-5p与表皮调节素存在靶向调控关系。目的:探讨miR-192-5p在增生性瘢痕中的表达及调控作用,并验证miR-192-5p与表皮调节素之间存在靶向调控关系。方法:①在新疆医科大学第一附属医院收集6例增生性瘢痕组织及6例正常皮肤组织,采用qRT-PCR法检测miR-192-5p与表皮调节素mRNA表达。②组织块法获取原代增生性瘢痕成纤维细胞,传代培养至3-6代用于后续实验,实验分为3个组:阴性对照组、miR-192-5p模拟物组和miR-192-5p抑制物组,分别转染对应的序列。采用CCK-8法和EdU试剂盒检测细胞增殖活力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡,qRT-PCR和Western blot法检测表皮调节素、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的基因和蛋白表达,生物信息学网站预测miR-192-5p靶点,双荧光素酶实验验证靶向结合。结果与结论:①与正常皮肤组织及其成纤维细胞相比,miR-192-5p和表皮调节素在增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中均呈高表达(P<0.05或P<0.01);②过表达miR-192-5p后,与阴性对照组比较,细胞增殖能力增强(P<0.05),EdU阳性细胞率增加(P<0.01);抑制miR-192-5p后细胞活力降低(P<0.05),EdU阳性细胞率减少(P<0.05);③过表达miR-192-5p 24 h后,与阴性对照组比较,模拟物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率减小(P<0.05),miR-192-5p抑制物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率增加(P<0.01);④转染48 h后,miR-192-5p模拟物组表皮调节素mRNA及蛋白水平显著降低、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白mRNA及蛋白水平显著增高(P<0.05或P<0.01);miR-192-5p抑制物组上述4项指标呈现相反的变化(P<0.05或P<0.01);⑤Targetscan网站预测表皮调节素与miR-192-5p有潜在结合位点;⑥双荧光素酶实验显示,miR-192-5p能够与表皮调节素靶向结合。结果说明:miR-192-5p过表达可降低表皮调节素的表达,二者可能存在负向调控;提示通过调控表皮调节素可能起到抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用。

β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析

背景:目前针对增生性瘢痕有效的预防和治疗措施仍然有限。而大多数植物中草药不良反应小且来源丰富,为预防和治疗增生性瘢痕提供了新的思路和方法。目的:通过网络药理学和分子对接技术探讨植物来源β-谷甾醇作用于增生性瘢痕成纤维细胞的潜在分子机制,并通过细胞学实验进行初步验证。方法:通过网络药理学方法,利用相关数据库及软件筛选β-谷甾醇的药物靶点,获取增生性瘢痕相关疾病靶点,取交集得到β-谷甾醇作用于增生性瘢痕的潜在作用(交集)靶点,使用Cytoscape软件和STRING数据库构建“药物-靶点-疾病”网络和蛋白质互作网络(PPI),同时筛选出PPI中核心作用靶点。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO生物学功能和KEGG通路富集分析,结合文献分析进一步确立与交集靶点关系密切的信号通路及核心靶点基因,应用AutoDock软件对β-谷甾醇和核心靶点蛋白进行分子对接。采用体外细胞实验验证β-谷甾醇对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和核心靶点基因mRNA表达的影响。结果与结论:①β-谷甾醇和增生性瘢痕的交集靶点共56个,PPI网络中筛选出10个核心靶点:酪氨酸激酶(SRC)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、载脂蛋白E(APOE)、雌激素受体1(ESR1)、固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、C-反应蛋白(CRP)、细胞间黏附分子1(ICAM1)和过氧化氢酶(CAT)。②结合文献报道和KEGG通路、GO功能分析结果,进一步认定MAPK信号通路与交集靶点关系密切,确定MAPK3(即为ERK1-MAPK)、CASP3、P53和肿瘤坏死因子为其核心靶点。③分子对接结果提示β-谷甾醇与核心靶点蛋白结合良好。④细胞实验结果表明,100μmol/L的β-谷甾醇能抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,降低线粒体膜电位、诱导细胞凋亡(P<0.01),使G1期细胞占比增加,S期细胞占比减少(P<0.05),同时上调CASP3、P53和肿瘤坏死因子mRNA表达(P<0.05),并下调MAPK3 mRNA表达(P<0.001)。⑤上述数据证实,β-谷甾醇可能通过激活肿瘤坏死因子通路,上调CASP3和P53的表达,诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡,同时抑制ERK-MAPK通路使细胞周期阻滞从而降低增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性。

miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了细胞的增殖过程,且miRNA参与增生性瘢痕的发生发展,因此深入探讨了miR-27a-3p和丝裂原活化蛋白激酶信号通路在病理性瘢痕形成中的作用。目的:探究miR-27a-3p通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集皮肤标本并分别分离出原代成纤维细胞,倒置显微镜观察原代细胞,免疫荧光予以验证;采用qRT-PCR检测miR-27a-3p在组织中的相对表达水平;利用数据库预测miR-27a-3p的靶基因,再将预测的靶基因进行基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书生物通路富集分析;设置分组为:空白对照组、阴性对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p抑制组、miR-27a-3p过表达+p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+c-Jun氨基末端激酶抑制剂组,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38激酶总量及其磷酸化水平,采用CCK-8法和EdU检测细胞增殖情况。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性更强(P<0.05),增殖速度也更快(P<0.001);②与正常皮肤相比,miR-27a-3p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.001);③与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p能促进细胞的增殖活性(P<0.001)和增殖水平(P<0.001);④与阴性对照组相比,敲低miR-27a-3p能抑制细胞的增殖活性(P<0.05)和增殖水平(P<0.001);⑤与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p促进细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);与阴性对照组相比,敲减miR-27a-3p能抑制细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);⑥与miR-27a-3p过表达组相比,细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂可逆转miR-27a-3p对成纤维细胞的增殖活性(P<0.01)和增殖水平(P<0.001);⑦提示miR-27a-3p通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

circ-0030042通过miR-145/PTEN轴调控对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响

目的:探讨circ-0030042与人第10号染色体缺失的磷酸酶(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的相互作用关系,并分析其在增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)患者中对成纤维细胞增殖与迁移的影响及作用机制。方法:通过circRNA序列和定量聚合酶链反应(PCR技术)检测正常皮肤成纤维细胞(NSFBs)和增生性瘢痕患者成纤维细胞(HSFBs)中circ-0030042的表达。用CCK8检测法检测转染48 h后的HSFBs细胞增殖情况。利用stubRFP-sensGFP-LC3基因转染、流式细胞仪及电子显微镜观察circ-0030042对miR-145/PTEN轴调控VEGF水平的表达。利用生物信息学分析、RNA免疫沉淀、免疫荧光检测等方法,揭示circ-0030042介导HS患者成纤维细胞增殖与迁移的作用机制。结果:circ-0030042在增生性瘢痕中显著上调,过表达时作为VEGF海绵抑制miR-145诱导的成纤维细胞,维持体内稳定性。此外,circ-0030042通过海绵化VEGF水平并阻断其miR-145捕获转录因子(FOXO1)mRNA来影响自噬,而circ-0030042诱导FOXO1的抑制被VEGF水平过表达或circ-0030042结合减少所抵消。过表达circ-0030042对成纤维细胞的增殖抑制与VEGF表达的抑制作用被过表达miR-145部分抵消。结论:干扰circ-0030042通过靶向下调miR-145/PTEN轴进而抑制HSFBs细胞的增殖与迁移,进一步诱导恶性细胞凋亡。

脂肪干细胞外泌体传递miR-145调控增生性瘢痕成纤维细胞生物学特性的实验研究

目的:探究脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)来源的外泌体(Exosome,Exo)传递miR-145对增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSF)生物学功能的影响。方法:从增生性瘢痕组织中分离培养HSF细胞,从脂肪组织中分离培养ADSCs,流式细胞术检测其表面标记物表达情况;采用含miR-145过表达慢病毒及阴性对照miR-NC慢病毒感染ADSCs,实时荧光定量PCR测定转染效果,并提取各转染组ADSCs上清液中Exo,获得含miR-145过表达的ADSCs来源Exo,利用透射电镜观察其形态、纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布以及Western blot检测表面标志性蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101的表达情况对提取的外泌体进行鉴定;添加外泌体培养HSF细胞,具体分组包括对照组、Exo组、miR-NCExo组、miR-145-Exo组,PKH26荧光标记的ADSC来源的Exos与HSF细胞培养,共聚焦荧光显微镜观察外泌体能否被细胞摄取,EdU检测各组HSF细胞的增殖能力,AnnexinⅤ-FITC/PI法检测各组HSF细胞的凋亡水平,Western blot检测各组细胞内凋亡相关蛋白(cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2)及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ)的蛋白表达水平。结果:成功分离到ADSCs,其表面标志物CD44、CD90及CD105均呈阳性表达;经miR-145过表达的慢病毒转染的miR-145-ADSCs组细胞中miR-145相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。分离到直径约100 nm、呈双层膜结构的杯状或球状以及外泌体标志蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101均为阳性表达的ADSCs来源Exo;将ADSCs来源Exo与HSF细胞共培养后,Exo可被HSF细胞摄取,miR-145过表达的ADSCs来源Exo能够明显抑制HSF细胞增殖(P<0.05),促进其凋亡(P<0.05),上调促凋亡蛋白cleavedcaspase-3和Bax的蛋白相对表达量(P<0.05),抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白相对表达量(P<0.05)。结论:脂肪干细胞来源的外泌体可通过传递miR-145抑制增生性瘢痕皮肤中成纤维细胞的增殖活性并促进其凋亡,其分子机制可能与上调cleaved-caspase-3和Bax的蛋白表达以及抑制Bcl-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达有关。

松萝酸对增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为及JNK/MAPK信号通路的影响

目的:探讨松萝酸对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFBs)增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并阐明其对c-Jun氨基末端激酶(JNK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的调节作用。方法:取对数生长期HSFBs分为对照组、10μmol·L^(-1)松萝酸组、20μmol·L^(-1)松萝酸组和50μmol·L^(-1)松萝酸组,除对照组外,其他各组细胞给予相应浓度松萝酸处理。噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Transwell小室实验检测各组细胞侵袭和迁移能力,Western blotting法检测各组细胞中磷酸化JNK(p-JNK)、JNK、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。结果:MTT法和流式细胞术检测,与对照组比较,10、20和50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞存活率均降低(P<0.05),细胞凋亡率均升高(P<0.05);与10μmol·L^(-1)松萝酸组比较,20和50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞存活率均降低(P<0.05),细胞凋亡率均升高(P<0.05);与20μmol·L^(-1)松萝酸组比较,50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞存活率降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。Transwell小室实验检测,与对照组比较,10、20和50μmol·L^(-1)松萝酸组侵袭细胞数和迁移细胞数均减少(P<0.05);与10μmol·L^(-1)松萝酸组比较,20和50μmol·L^(-1)松萝酸组侵袭细胞数和迁移细胞数均减少(P<0.05);与20μmol·L^(-1)松萝酸组比较,50μmol·L^(-1)松萝酸组侵袭细胞数和迁移细胞数均减少(P<0.05)。Westernblotting法检测,与对照组比较,10、20和50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞中Bcl-2蛋白表达水平均降低(P<0.05),Bax和p-JNK蛋白表达水平均升高(P<0.05);与10μmol·L^(-1)松萝酸组比较,20和50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞中Bcl-2蛋白表达水平均降低(P<0.05),Bax和p-JNK蛋白表达水平均升高(P<0.05);与20μmol·L^(-1)松萝酸组比较,50μmol·L^(-1)松萝酸组细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05),Bax和p-JNK蛋白表达水平均升高(P<0.05)。结论:松萝酸可抑制HSFBs增殖、侵袭和迁移,诱导HSFBs凋亡,并激活JNK/MAPK信号通路。

PI3K/AKT/mTOR信号通路介导黄芩苷抑制增生性瘢痕组织成纤维细胞的增殖

黄芩苷作为一种黄酮类成分可通过抑制细胞增殖、促进凋亡发挥抗肿瘤作用，但它是否对异常增生的瘢痕具有抑制增生的作用尚不清楚．本研究探讨黄芩苷抑制人增生性瘢痕组织成纤维细胞增殖的分子机制．采用MTT比色法检测不同浓度的黄芩苷（2．24×10^-2～2．24×10^2mmol／L）对体外培养的增生性瘢痕组织成纤维细胞增殖的抑制作用．发现浓度为2．24×10^0～2．24×10^2mmol／L黄芩苷处理组明显抑制增生性瘢痕组织成纤维细胞的增殖（P〈0．05）．转染后的荧光素酶报告基因活性检测、RT—PCR及Western印迹分析技术检测其mRNA水平及细胞的帽状依赖翻译的表达．2．24×10^2mmol／L黄芩苷处理后，黄芩苷作用组的mRNA水平并无明显差异（P〉0．05）；增生性瘢痕成纤维细胞的帽状依赖结构的翻译明显被黄芩苷所抑制．采用Western印迹分析检测被黄芩苷干预的增生性瘢痕组织成纤维细胞的增殖相关的蛋白的表达；m^7GTP琼脂糖殊沉淀结合蛋白4E—BPl与elF4E的变化．发现增殖相关的蛋白mTOR、p70S6K、S6、4EBPl、elF4E及其上游的AKT表达明显下调（P〈0．05），而PTEN表达明显上调．p-AKT（Ser473）、p-mTOR（Ser2448）、p．S6（Ser235／236）、p4EBPl（Thr37／46）、p-PTEN（T380／S382／383）磷酸化水平下降（P〈0．05）．在黄芩苷作用下的增生性成纤维细胞中的游离的4E。BPl明显减少（P〈0．05），而与eIF4E结合的4E．BPl明显增加（P〈0．05）黄芩苷诱导游离的4E—BP1与eIF4E结合，从而抑制帽状依赖蛋白翻译．以上结果说明，黄芩苷可通过抑制P13K／AKT／mTOR信号通路抑制人增生性瘢痕组织成纤维细胞的增殖．

紫草素调控MicroRNA-382-5p抑制人增生性瘢痕成纤维细胞纤维化

背景:目前已有研究表明紫草素具有治疗增生性瘢痕的潜力,且miRNA参与增生性瘢痕的病理机制调控,猜测紫草素有可能通过影响miRNA调控增生性瘢痕的发生发展。目的:探讨紫草素通过影响MicroRNA-382-5p对人增生性瘢痕成纤维细胞纤维化的作用机制。方法:收集宁夏医科大学总医院烧伤整形外科提供的增生性瘢痕组织及瘢痕旁正常皮肤组织(瘢痕旁3 cm以内),并分别分离出人增生性瘢痕成纤维细胞和正常成纤维细胞用于后续实验。苏木精-伊红染色鉴定正常皮肤和增生性瘢痕;免疫荧光鉴定成纤维细胞;采用实时荧光定量PCR从组织水平检测MicroRNA-382-5p相对表达水平。将增生性瘢痕成纤维细胞随机分为紫草素组(紫草素溶于二甲基亚砜配成浓度为13.46μmol/L的药物干预细胞24 h)、二甲基亚砜组、MicroRNA-382-5p阴性对照组、MicroRNA-382-5p抑制组、紫草素+MicroRNA-382-5p阴性对照组及紫草素+MicroRNA-382-5p过表达组。实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原蛋白α1、Ⅲ型胶原蛋白α1和α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达;Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白α1、Ⅲ型胶原蛋白α1和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达;CCK-8法检测细胞活性;划痕实验检测细胞迁移能力。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性更强(P<0.01);②与二甲基亚砜组相比,紫草素组可以下调增生性瘢痕成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1、Ⅲ型胶原蛋白α1和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平(mRNA:P<0.01,蛋白:P<0.01),并抑制增生性瘢痕成纤维细胞迁移(P<0.05);③与正常皮肤相比,MicroRNA-382-5p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.01),且紫草素能下调增生性瘢痕成纤维细胞中MicroRNA-382-5p的表达(P<0.01);④敲低MicroRNA-382-5p能下调增生性瘢痕成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1、Ⅲ型胶原蛋白α1和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平(mRNA:P<0.01,蛋白:P<0.01),并抑制增生性瘢痕成纤维细胞迁移(P<0.05);⑤过表达MicroRNA-382-5p能上调在紫草素影响下增生性瘢痕成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1、Ⅲ型胶原蛋白α1和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平(mRNA:P<0.01,蛋白:P<0.01),并促进增生性瘢痕成纤维细胞迁移(P<0.01);⑥提示紫草素可通过下调MicroRNA-382-5p的表达抑制增生性瘢痕成纤维细胞的纤维化和迁移。

miR-382-3p抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了miRNA影响增生性瘢痕的发生发展,STAT1参与瘢痕成纤维细胞的增殖过程,猜测miR-382-3p也有可能与增生性瘢痕的发生发展有关系。目的:探讨miR-382-3p对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用机制。方法:收集宁夏医科大学总医院烧伤整形外科提供的增生性瘢痕和同一个体正常皮肤,提取人增生性瘢痕成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞;细胞转染分别设置:①对照组(不做处理)、miR-382-3p阴性对照组、miR-382-3p过表达组;②对照组(不做处理)、STAT1干扰对照组(si-NC)和STAT1干扰组(si-STAT1-1、si-STAT1-2、si-STAT1-3)。苏木精-伊红染色鉴定正常皮肤和增生性瘢痕;免疫荧光鉴定成纤维细胞;qRT-PCR检测miR-382-3p、STAT1、增殖细胞核抗原及细胞周期依赖性激酶抑制物(p27)mRNA表达;Western blot检测STAT1、增殖细胞核抗原及p27蛋白表达;CCK8、EdU检测细胞增殖活力和增殖水平;Targetscan预测miR-382-3p的下游靶基因,双荧光素酶验证miR-382-3p与STAT1的结合情况。结果与结论:①与正常皮肤和正常皮肤成纤维细胞相比,miR-382-3p在增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中呈低表达(组织:P<0.01,细胞:P<0.01),STAT1在增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中呈高表达(组织水平mRNA:P<0.01,组织水平蛋白:P<0.01;细胞水平mRNA:P<0.01,细胞水平蛋白:P<0.01);②过表达miR-382-3p后细胞增殖能力减弱(P<0.05),EdU阳性细胞数减少(P<0.01),增殖细胞核抗原的表达减少(mRNA:P<0.01,蛋白:P<0.05),p27的表达增加(mRNA:P<0.05,蛋白:P<0.05);③miR-382-3p能够靶向调控STAT1的表达(P<0.01),过表达miR-382-3p可导致STAT1的表达减少(mRNA:P<0.01,蛋白:P<0.01);④干扰STAT1后可导致增殖细胞核抗原的表达减少(P<0.05),p27的表达增加(P<0.05),EdU阳性细胞数减少(P<0.01);⑤结果表明:miR-382-3p可通过抑制STAT1的表达进而抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,为未来增生性瘢痕的治疗寻找有效靶点提供一定的理论依据。

铁死亡诱导剂抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:增生性瘢痕是各种原因导致的皮肤创伤后愈合过程中出现的一种病理性瘢痕,目前缺乏特效治疗方法。目的:探讨铁死亡诱导剂Erastin对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集宁夏医科大学总医院烧伤整形外科提供的增生性瘢痕组织和同一个体正常皮肤,提取人增生性瘢痕成纤维细胞进行后续实验。将细胞分为对照组(不做处理)和铁死亡诱导剂组(用20μmol/L的Erastin干预细胞24 h),Western blot检测铁蛋白(Ferritin)的表达,铁离子检测试剂盒测定细胞铁离子浓度,丙二醛检测试剂盒检测细胞丙二醛水平;将细胞分为对照组(不做处理)、铁死亡诱导剂组(用20μmol/L的Erastin干预细胞24 h)和铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组(用20μmol/L的Erastin和20μmol/L的Ferrostatin-1同时干预细胞24 h),qRT-PCR检测PCNA及p27的mRNA表达,Western blot检测PCNA及p27的蛋白表达,CCK-8、EdU检测细胞增殖活力和增殖水平。结果与结论:①与对照组相比,铁死亡诱导剂组铁蛋白减少(P<0.01),铁离子增多(P<0.05),丙二醛增多(P<0.01);②与对照组相比,铁死亡诱导剂组PCNA的表达降低(P<0.01),p27的表达增加(P<0.05),细胞增殖能力减弱(P<0.01),EdU阳性细胞数减少(P<0.01);③与铁死亡诱导剂组相比,铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组PCNA的表达增加(P<0.05),p27的表达降低(P<0.05),细胞增殖能力增强(P<0.01),EdU阳性细胞数增多(P<0.05);④结果表明,铁死亡诱导剂Erastin通过诱导增生性瘢痕成纤维细胞发生铁死亡进而抑制其增殖。

PTEN介导紫草素抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的胶原沉积

目的从PTEN角度探讨紫草素对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原沉积的影响。方法苏木精-伊红染色(HE染色)和马松染色(Masson染色)鉴定增生性瘢痕组织,免疫荧光鉴定人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFBs);Western blot检测人增生性瘢痕(HS)和同一个体正常皮肤(NS)组织中PTEN表达水平;将HSFBs随机分组为:DMSO组、shikonin组、control组、si-NC组、si-PTEN组、shikonin+si-NC组和shikonin+si-PTEN组;Western blot检测各组中PTEN和胶原相关蛋白(Col1、Col3、α-SMA)的表达。结果与正常皮肤组织相比,PTEN在增生性瘢痕组织中呈低表达(P<0.05);用IC50浓度(13.46μmol/L)的紫草素干预人增生性瘢痕成纤维细胞24 h后,人增生性瘢痕成纤维细胞中Col1、Col3和α-SMA的表达降低(P<0.05),而PTEN的表达升高(P<0.05);转染si-PTEN后,与si-NC组相比,人增生性瘢痕成纤维细胞中Col1,Col3和α-SMA的表达升高(P<0.05);共转染shikonin+si-PTEN后,与shikonin+si-NC组相比,人增生性瘢痕成纤维细胞中Col1、Col3和α-SMA的表达升高(P<0.05)。结论紫草素可通过上调PTEN的表达抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原沉积。

5-氨基酮戊酸光动力疗法对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β_(1)/Smads信号通路的影响

目的:探究5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-ALA-PDT)对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads信号通路的影响。方法:选取2020年1月至2022年8月收治的增生性瘢痕患者66例进行研究,将其均分为两组,其中对照组给予单纯激光治疗,研究组给予5-ALA-PDT治疗,同时对两组均进行瘢痕组织成纤维细胞培养。比较治疗后两组瘢痕组织成纤维细胞的增殖情况,同时观察不同浓度5-氨基酮戊酸(5-ALA)对瘢痕组织成纤维细胞前胶原mRNA表达的影响,并总结5-ALA对MAPK信号通路中ERK、JNK和P38的影响。结果:(1)研究组不同浓度5-ALA下成纤维细胞的增殖能力均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(2)研究组不同浓度5-ALA对成纤维细胞前胶原(包括Ⅰ前胶原/β-actin、Ⅲ前胶原/β-actin)mRNA表达的影响不同,且均低于对照组(P<0.05)。(3)通过体外细胞培养,给予不同浓度5-ALA测定发现,0.5 mmol/L、1.0 mmol/L浓度的5-ALA对TGF-β_(1)的分泌起到了抑制作用,对基质金属蛋白酶1(MMP-1)的分泌起到了诱导作用。(4)研究组中,观察到MAPK家族的信号在0.5 mmo/L时明显增强,与对照组相比,ERK(44 ku)、P38(38 ku)和JNK(46 ku)分别增加了113.0%、36.0%和67.0%(P<0.05)。结论:采用5-ALA-PDT治疗增生性瘢痕可取得一定的成效。5-ALA-PDT可通过抑制Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白基因的合成来抑制增生性瘢痕中成纤维细胞的增殖,并对TGF-β_(1)起到抑制作用,对MMP-1起到诱导作用,同时观察到MAPK信号通路在浓度为0.5 mmo/L的5-ALA下增强,该浓度可作为5-ALA-PDT治疗增生性瘢痕的参考浓度。

结缔组织生长因子体外促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的研究结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)在人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用。方法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,分别给予不同剂量CTGF刺激(10ng/ml),以及CTGFASODN转染,48h后用Westernblot方法比较各组间α平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)的表达变化。结果刺激48h后,对照组表达少量αSMA蛋白;小剂量CTGF刺激组和大剂量CTGF刺激组作用48h后,αSMA表达量均显著增多,且成浓度依赖性变化(P<0.01);而CTGFASODN转染组αSMA蛋白表达与对照组比较明显减少(P<0.05)。结论CTGF在体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)的转分化,阻断或者抑制其表达可能将更有效的治疗瘢痕挛缩。

RhoA/ROCK-I信号通路与增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

背景:前期实验表明增生性瘢痕中RhoA和ROCK-I基因表达较正常皮肤高,提示RhoA/ROCK-I信号通路可能参与了增生性瘢痕的发生,但其在病理性瘢痕中的作用尚不清楚。目的:研究RhoA/ROCK-I信号通路在增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达调控中的作用。方法:分离培养人增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞,应用转化生长因子β1及Rho激酶的特异抑制剂Y-27632对细胞进行干预实验。采用实时荧光定量PCR及免疫荧光细胞化学方法检测瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF mRNA与蛋白的表达。结果与结论:给予转化生长因子β1后,增生性瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF mRNA与蛋白表达明显增多(P<0.01);而Y-27632能阻碍转化生长因子β1的作用;但单独给予Y-27632并不引起瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF的mRNA与蛋白表达改变。说明转化生长因子β1可通过RhoA/ROCK-I信号通路调控CTGF mRNA与蛋白的表达,即RhoA/ROCK-I信号通路参与了瘢痕成纤维细胞CTGF的表达调控,阻断RhoA下游通路是增生性瘢痕治疗靶点之一。

针刀松解法对移植于裸鼠的人皮肤增生性瘢痕组织中成纤维细胞的影响

目的观察针刀松解法对移植于裸鼠皮下人增生性瘢痕成纤维细胞增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclearantigen,PCNA)、Ⅰ、Ⅲ型胶原、bcl-2和bax的作用,探讨其对移植于裸鼠皮下的人增生性瘢痕组织中成纤维细胞生物学特性的影响。方法取6例人增生性瘢痕组织,削去瘢痕表皮及皮下组织,将每例增生性瘢痕组织分成重约0.2 g的3块,每只裸鼠移植1块,共移植于18只裸鼠背部皮下,建立增生性瘢痕裸鼠动物模型。移植后10 d在瘢痕组织内分3点分别注射生理盐水0.1 ml(对照组)、注射0.1 mg/ml曲安奈德0.1 ml(曲安奈德组)、将小针刀刺进瘢痕组织内,在瘢痕内向四周切割剥离至瘢痕周边(针刀松解组)进行治疗,每组6只。治疗后14 d取材,利用HE染色计数分析各组成纤维细胞的含量;免疫组织化学染色检测各组PCNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、bcl-2和bax表达阳性成纤维细胞数的变化。结果 HE染色结果:与对照组成纤维细胞数量(913.33±148.95)个/mm2相比,曲安奈德组(853.33±62.82)个/mm2和针刀松解组(863.33±75.28)个/mm2均降低,但是差异无显著性(P>0.05)。免疫组织化学染色结果:曲安奈德组和针刀松解组PCNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白阳性的成纤维细胞数量减少,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);3组bcl-2和bax阳性的成纤维细胞数量以及bcl-2/bax比率差异无显著性(P>0.05)。结论 针刀松解法具有抑制移植于裸鼠皮下人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和分泌合成的能力;针刀松解对增生性瘢痕成纤维细胞中bcl-2和bax表达及其比率没有影响。

增生性瘢痕组织中成纤维细胞活性功能研究

为全面系统了解瘢痕增生过程中成纤维细胞的活性功能状况，实验通过４０例不同时期的瘢痕增生组织进行成纤维细胞核内增殖抗原（ＰＣＮＡ）、核仁组成区嗜银蛋白（ＡｇＮＯＲｓ）和氨基酸分析检测。结果发现：ＰＣＮＡ的蛋白表达主要在１和３个月时期的瘢痕成纤维细胞核内，细胞内ＡｇＮＯＲｓ在１个月～９个月瘢痕增生组织中明显高于１２个月以后的瘢痕组织及正常皮肤内水平；组织总氨基酸量随瘢痕增生发展逐渐递增，但以瘢痕增生１个月时期为最快（２０６．７４μｇ／ｍｇ组织），代表胶原含量的羟脯氨酸则在瘢痕发展３个月～６个月之间提高最快（１７．０５μｇ／ｍｇ组织），６个月～９个月之间下降为５．１１μｇ／ｍｇ组织，９个月～１２个月为１．３１μｇ／ｍｇ组织。由此提示：在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞的增殖旺盛阶段在瘢痕形成早期，胶原蛋白沉积在６个月时期左右也基本完成，但其它细胞外间质如胶原蛋白，蛋白多糖纤维结合蛋白等在１２个月以后的瘢痕组织中仍有聚集。

结缔组织生长因子通过PI3K/PKB抑制人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡

目的探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是否具有抑制人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HSF)凋亡的作用及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K/PKB)是否介导该效应。方法体外培养HSF,实验分3组:空白对照组,②CTGF刺激组(10ng/ml),③PI3K抑制剂LY294002(10μmol/L)预处理后CTGF刺激组(LY294002组)。应用免疫印迹技术检测30min后蛋白激酶B的活化情况,应用流式细胞术检测细胞凋亡。结果和空白对照组相比,CTGF组细胞凋亡指数下降,蛋白激酶B的活化水平升高,具有统计学差异(P<0.05);LY294002组细胞凋亡指数上升,蛋白激酶B的活化水平没有升高,与CTGF组比较具有显著性差异(P<0.05)。结论CTGF能够抑制HSF凋亡,PI3K/PKB介导该效应。

血清miR-29b miR-320表达水平与烧伤患者增生性瘢痕组织炎性反应和氧化应激反应的关系

目的探讨血清miR-29b、miR-320表达水平与烧伤患者增生性瘢痕组织炎性反应和氧化应激反应的关系。方法选取94例烧伤患者设为研究组,另选取同期42名健康体检者设为对照组。检测并比较两组受试者血清mi R-29b、miR-320表达水平,炎性反应指标[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)]和氧化应激反应指标[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)],采用Pearson法分析研究组患者血清mi R-29b、miR-320表达水平与炎性反应和氧化应激反应指标关系。结果研究组患者血清miR-29b、miR-320、SOD表达水平均低于对照组(P<0.01),血清TNF-α、IL-6、MDA表达水平均高于对照组(P<0.01)。研究组患者血清miR-29b、miR-320表达水平分别与TNF-α、IL-6、MDA表达水平呈负相关,与SOD表达水平呈正相关(P<0.01)。结论烧伤患者血清miR-29b、miR-320呈低表达水平,且其表达水平与增生性瘢痕组织炎性反应和氧化应激反应具有相关性,mi R-29b、miR-320可能通过调控应激反应和炎性反应指标因子参与烧伤患者增生性瘢痕组织发生与进展。

结缔组织生长因子在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 :探讨结缔组织生长因子 (CTGF)在人类增生性瘢痕成纤维细胞中的表达与瘢痕纤维化之间的关系。方法 :应用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)和 Western blot技术 ,检测了瘢痕组织原代培养的成纤维细胞中 CTGFm RNA及蛋白表达。结果 :CTGF m RNA及蛋白在人类增生性瘢痕成纤维细胞中高度表达 ,与正常皮肤组织的成纤维细胞比较 ,差异有显著性意义 (P<0 .0 1)。结论 :CTGF在人类增生性瘢痕成纤维细胞中呈高度表达 ,提示其在增生性瘢痕的纤维化进程中起着重要的作用 ,这为临床上寻找安全、有效的治疗增生性瘢痕药物提供了可能。

结缔组织生长因子反义寡核苷酸体外对人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响

目的:观察结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)体外对人增生性瘢痕组织中成纤维细胞凋亡的影响并探讨其可能的作用机制。方法:体外培养的人增生性瘢痕组织中成纤维细胞,分为CTGF-ASODN脂质体治疗组(ASODN treatment,AT)、空白脂质体对照组(liposome control,LC)和空白对照组(control,C),荧光显微镜观察各组CTGF-ASODN时相性分布,流式细胞术检测各组凋亡率随时相的变化,观察Fas受体表达;RT-PCR检测各组CTGF、Fas、bcl-2 mRNA的表达。砖果:AT组细胞转染24 h后胞质内可见有大量黄绿色荧光,呈离散型、点状分布,而LC和C组成纤维细胞内未见荧光。转染24 h后LC组和C组成纤维细胞的凋亡率及Fas受体阳性表达率无显著差异;而AT组凋亡率及Fas受体阳性表达率明显增加,明显高于LC组和C组(P<0.01)。RT-PCR结果表明,转染组CTGF mRNA相对表达量明显低于空白对照组(P<0.05),Fas mRNA表达明显高于空白对照组(P<0.01),转染组bcl-2 mRNA与空白对照组无显著差异。结论:CTGF反义寡核苷酸体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡,可能与其上调Fas mRNA及其蛋白表达有关。