结肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu中microRNA表达的初步研究

目的建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关的microRNA。方法采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用microRNA芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中mi-croRNA的表达谱,筛选差异表达的microRNA;用实时荧光定量PCR方法对筛选出的部分差异microRNA在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证。结果 LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大,耐药株LoVo/5-FU细胞相对于其亲本LoVo细胞的耐药倍数为8.08。microRNA芯片的结果显示,耐药株LoVo/5-FU细胞与亲本LoVo细胞比较,有10个microRNA表达上调,13个microRNA表达下调;实时荧光定量pcr的结果进一步证实mir-210、mir196a、mir-1281在LoVo/5-FU中显著上调,而let-7f、mir-1228显著下调,其中mir-210在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异。结论 LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,筛选获得的差异miRNA可能通过调控其靶基因而参与人结肠癌细胞对5-Fu的耐药,为进一步研究microRNA在结肠癌耐药机制中的作用奠定基础。

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选

目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线:用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cy5/Cv3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.

CXCR3B在结肠癌组织中的表达及对结肠癌LOVO细胞株迁移能力的影响

目的探讨趋化因子受体CXCR3B(CXC型趋化因子受体3变体B)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌LOVO细胞株迁移能力的影响。方法常规收取结直肠癌及癌旁组织标本,用免疫组织化学(IHC)染色方法检测CXCR3B的表达;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测正常肠上皮细胞株NCM460及结肠癌细胞株LOVO中的CXCR3B m RNA表达,过表达CXCR3B-RFP慢病毒感染LOVO细胞株,划痕实验及transwell实验检测LOVO细胞株的迁移变化。结果免疫组织化学结果显示在结直肠癌旁组织中CXCR3B的表达显著高于癌组织(P<0.001);NCM460细胞中CXCR3B m RNA表达高于LOVO细胞表达(P<0.01)。划痕实验及transwell迁移实验显示过表达CXCR3B组(LOVO-CXCR3B)细胞迁移较阴性对照组(LOVO-NC)低(P<0.01)。结论人结直肠癌组织中CXCR3B低表达,过表达CXCR3B可抑制结肠癌细胞株LOVO的迁移。

胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对人大肠癌SW480细胞株作用及机理

目的:探讨胃泌素受体拮抗剂丙谷胺(PGL)对人大肠癌SW480细胞株活细胞数、DNA和蛋白质合成及细胞增殖周期的影响,为大肠癌病人应用丙谷胺治疗提供实验依据。方法:用MTT比色分析法测活细胞数,流式细胞术测DNA、蛋白质和细胞增殖周期。结果:PGL组活细胞数、DNA和蛋白质合成、细胞周期分布和增殖指数(PI)与对照组比无显著性(P均>0.05)。PG(5肽胃泌素)组活性细胞数明显高于对照组(P<0.01)。PGL+PG组活细胞数、DNA和蛋白质合成、S、G_2M期细胞数及PI均明显低于PG组(P均<0.01),G_0/G_1期细胞数明显高于PG组(P<0.01),而与对照组比均无显著性(P均>0.05)。结论,PG对大肠癌SW480细胞株生长无明显影响,但可抑制胃泌素对大肠癌细胞的促增殖作用,其作用机理为抑制胃泌挛对癌细胞的DNA和蛋白质的合成,从而抑制癌细胞从G_0/G_1期过渡到S、G_2M期。

大蒜素对结肠癌LoVo细胞增殖的影响

目的:观察大蒜素对结肠癌细胞LoVo生长、细胞凋亡及细胞周期的影响。方法:不同浓度的大蒜素作用于体外培养的LoVo细胞,倒置显微镜下观察LoVo细胞的形态学变化,采用MTT法检测大蒜素对LoVo细胞增殖抑制能力,An-nexinV-FITC标记流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞的凋亡抑制率,流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞周期影响。结果:大蒜素可抑制人结肠癌LoVo细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,24、48和72h大蒜素抑制LoVo细胞的IC50分别为32.23、10.74和6.58μg/ml;大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,作用24h其诱导凋亡率随着药物浓度的递增具有增高趋势,作用48h其诱导凋亡作用峰值浓度为8μg/ml,后再继续增加浓度凋亡率反而下降;大蒜素作用LoVo细胞24h后,大蒜素浓度低于4μg/ml时,LoVo细胞周期被阻滞于G2/M;而高于4μg/ml时,细胞周期被阻滞于G2/M和G1期。结论:大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。

反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响。方法构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株。采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P<0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M期细胞数量分布减少。而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变。结论成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因。

马尾松树皮提取物体外抑制人大肠癌细胞生长机理初探

为探讨马尾松树皮提取物(PMBE)体外抑制大肠癌LoVo细胞生长的作用特点和机理,通过MTT、显微镜术、凝胶电泳和流式细胞术,研究PMBE抑制LoVo细胞生长的特点,运用免疫组化和RT-PCR探究相关分子机理。结果表明:PMBE时间-剂量依赖地抑制LoVo细胞的体外生长;PMBE处理后,流式细胞检测发现LoVo细胞周期阻滞于G1或S期,同时可检测到亚二倍体峰的出现;荧光镜检和透射电镜观察可看到LoVo细胞的核皱缩、边集甚或碎裂,以及有凋亡小体形成,其基因组经过凝胶电泳呈现典型的梯形Ladder;RT-PCR和免疫组化结果显示PMBE处理可上调LoVo细胞中p53和p21基因的转录效率,并下调Bcl-2的蛋白表达量。说明PMBE通过上调p53和p21的表达量阻滞细胞周期、下调Bcl-2的表达量诱导细胞凋亡的双重机制,抑制LoVo细胞的体外生长,可供进一步探索相关信号传导通路参考。

LoVo细胞系中结肠癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定

目的:从结肠癌LoVo细胞系中分离、鉴定具有CD44+/EPCAMhigh特异表型的结肠癌干细胞样细胞,观察其生物学行为,证实该细胞系中结肠癌干细胞样细胞的存在。方法:从普通血清培养的LoVo细胞系中以流式细胞仪分选具有CD44+/EPCAMhigh表型的细胞,接种于添加生长因子的无血清培养基中,观察其增殖过程,继而诱导分化。MTT法、流式细胞术检测CD44+/EPCAMhigh、EPCAMlow和未分选LoVo细胞的增殖能力及细胞周期分布。3种细胞接种裸鼠,比较不同细胞的成瘤率;免疫荧光技术检测小鼠次代CD44+/EPCAMhigh细胞中CD44/EPCAM的表达。结果:LoVo细胞中有17.4%的CD44+/EPCAMhigh细胞,并能在添加生长因子的无血清培养基中呈细胞球样生长,且可连续传代;在血清的诱导下,呈贴壁分化生长,其形态与未分选LoVo细胞无差别。CD44+/EPCAMhigh细胞增殖能力高于EPCAMlow细胞及未分选LoVo细胞,且细胞周期多集中在G0/G1期。以500个CD44+/EPCAMhigh细胞接种裸鼠成瘤率为90%(9/10),而1×104个EPCAMlow细胞成瘤率为0(0/10)。小鼠移植瘤中次代CD44+/EPCAMhigh细胞仍能少量表达CD44和EPCAM。结论:LoVo细胞中存在CD44+/EPCAMhigh结肠癌干细胞样细胞,CD44+/EPCAMhigh可用于结肠癌肿瘤干细胞的深入研究。

中成药逆转人结肠癌细胞株对化疗药物耐药的研究

目的:本研究拟观察鸦胆子油乳注射液、华蟾素注射液和注射用黄芪多糖对结肠癌耐药细胞株的杀伤作用,为临床合理、有效使用中成药提供实验依据。方法:运用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结肠癌lovo细胞耐5-氟尿嘧啶细胞株,并命名为lovo/5-Fu。MTT法检测lovo/5-Fu的耐药能力及不同浓度中成药对lovo/5-Fu细胞株的耐药逆转作用,并根据相应结果计算耐药逆转倍数(RF)。细胞迁移实验分为4组:空白对照组、黄芪多糖组、鸦胆子组和华蟾素组,检测不同中成药对lovo/5-Fu细胞株迁移能力的影响。结果:5-Fu对lovo细胞株的IC_(50)为14.5 mg/L,对lovo/5-Fu细胞株的IC_(50)为115.1 mg/L,根据上述两株细胞的IC_(50)可算出lovo/5-Fu细胞株对5-Fu的耐药指数为:7.94。浓度为17.3、45.3、83.8、112.5 mg/L鸦胆子油乳注射液的耐药逆转倍数分别为9.5、23.5、54.4、86.5倍;浓度为8.2、21.2、38.6、50.1 mg/L华蟾素注射液的耐药逆转倍数分别为11.2、25.2、56.6、90.5倍;浓度为26.3、70.9、115.2、163.4 mg/L注射用黄芪多糖的耐药逆转倍数分别为1.5、8.2、26.5、74.2倍。与空白对照组比较,黄芪多糖组、鸦胆子组和华蟾素组侵出小室的细胞数目明显减少,迁移能力明显减弱,其中以鸦胆子组和华蟾素组更为明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:鸦胆子油乳注射液、华蟾素注射液和注射用黄芪多糖这三种中成药均能不同程度的逆转lovo/5-Fu对5-Fu的耐药性,其中以鸦胆子油乳注射液和华蟾素注射液最为明显。

血桐叶水提物对人结肠癌LoVo细胞的增殖抑制作用

水煮浸提血桐叶,减压浓缩后冻干制成粗体样品;以MTT、生长曲线法、集落形成实验考察血桐叶提取物对人结肠癌LoVo细胞的增殖抑制作用,并且以倒置显微镜观察其对细胞形态影响.实验结果表明,血桐叶水提物对LoVo细胞的增殖有显著抑制作用,呈明显剂量依赖关系,并且对细胞的形态有改变作用.

人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因mRNA表达的研究

目的建立紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol,探讨结肠癌细胞紫杉醇获得性耐药的可能机制。方法反复用紫杉醇处理结肠癌LoVo细胞,诱导建立结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol;通过MTT法检测细胞药物敏感性,光学显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR法测定细胞中多药耐药基因MDR1、MRP1、LRP、GST-π和TopoⅡ的表达。结果建立的紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol对紫杉醇的耐药指数为42,为高度耐药;对阿霉素及5-氟脲嘧啶也产生强烈的交叉耐药,耐药指数分别为796和187。相较于亲本细胞LoVo,LoVo/Taxol细胞形态发生明显的变化,G2/M期阻滞和细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。在五种经典的耐药相关蛋白中MRP1、MDR1基因m RNA的转录水平分别提高了37倍和2倍,LRP、GST-π基因m RNA的转录水平分别下降了11倍和3倍(P均<0.05),To Po II基因转录水平无明显变化。结论成功建立的人结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol为典型的多药耐药细胞模型,其耐药机制可能与MRP1基因的过表达有关。

高低转移表型大肠癌细胞株蛋白质表达谱差异初步分析

目的:应用蛋白质组学技术分析高低转移表型大肠癌SW480 细胞株和LoVo细胞株间的蛋白质表达谱差异. 方法:以双向电泳技术分离两种细胞株总蛋白质,银染显色,进行差异蛋白质分析. 结果:SW480和LoVo细胞株双向电泳图谱蛋白质点数分别为1184±47和1124±54,共获得88±5的蛋白质差异点,其中48±3个点仅在SW480细胞株中表达或表达明显增强, 41±3个点仅在LoVo细胞中表达或表达明显增强. 结论:高低转移表型大肠癌SW480细胞株和LoVo细胞株间的蛋白质表达谱存在一定的差异,对这些差异点进行鉴定将为研究大肠癌转移机制提供一定的线索.

草分枝杆菌制剂对人结肠癌细胞周期动力学的调控

目的 :探讨草分枝杆菌制剂对人结肠癌细胞周期动力学的影响。 方法 :以不同浓度的草分枝杆菌制剂(商品名乌体林斯 ,UtilinS)体外处理人结肠癌细胞株Lovo,4 8h后以流式细胞仪检测细胞周期动力学指标的变化。结果 :4种不同浓度的药物均能调控Lovo细胞的细胞周期 ,使G0 ～G1期细胞数率非常显著地上升 (P <0 .0 1) ,G2 ～M期细胞数率显著地上升 (P <0 .0 5 ) ,同时使S期细胞数率非常显著地下降 (P <0 .0 1)。 结论 :乌体林斯能直接抑制结肠癌细胞株Lovo增殖 ,并可能通过G2

TNFα诱导大肠癌细胞凋亡的实验研究

目的：探索肿瘤坏死因子a（TNFa）诱导人大肠癌细胞凋亡的可能性及其发生规律。方法 用细胞体外培养方法，以TNFa不同剂量，不同时间作用于入大肠癌Lovo细胞，经Hoechst33258荧光染色，光镜观察细胞的形态改变；DNA抽提、琼脂糖凝胶电泳，检测DNA断裂情况。结果：TNFal×10^5μ/ml作用12-48h和1×10^4-1×10^5μ/ml作用45h，Lovo细胞出现逐渐明显的凋亡形态学改变，1×10^5μ/ml作用48h，DNA电泳出现显示凋亡特性的梯形条带。结论 TNFa能够诱导人大肠癌Lovo细胞凋亡，并存在时间与剂量效应。

TNF_α诱导大肠癌细胞凋亡的实验研究

目的探索肿瘤坏死因子α(TNF_α)诱导人大肠癌细胞凋亡的可能性及其发生规律。方法用细胞体外培养方法,以TNF_α不同剂量、不同时间作用于人大肠癌Lovo细胞,经Hoechsl 33258荧光染色,光镜观察细胞的形态改变;DNA抽提、琼脂糖凝胶电泳,检则DNA断裂情况。结果TNFal×10~5μ/ml作用12-48h和J×10~4-1 x10^5μ/ml作用48h.Lovo细胞出现逐渐明显的凋亡形态学改变;1×10~5μ/ml作用48h.DNA电泳出现显示凋亡特性的梯形条带。结论TNF_α能够诱导人大肠癌Lovo细胞凋亡,并存在时间与效果效应。

SDZ对人大肠癌LOVO细胞系的作用及其对E-、N-Cadherin表达的影响

目的:研究SDZ对人大肠癌LOVO细胞系的作用及其对上皮型、神经型钙黏蛋白(E-、N-Cadherin)表达的影响。方法:用倒置显微镜和电镜观察SDZ对人大肠癌LOVO细胞的凋亡情况,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测加药后E-、N-Cadherin的表达情况。结果:SDZ对人大肠癌LOVO细胞株有促进凋亡的作用;对E-Cadherin的表达有上调作用,对N-Cadherin的表达无影响。结论:SDZ有加强肿瘤细胞间的黏附性,降低肿瘤浸润和转移的能力。

丙谷胺与奥曲肽对人大肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

胃泌素（GAS）对结直肠癌细胞的增殖具有促进作用，而生长抑素（SS）具有广泛的抑制作用，可抑制大肠癌的生长。本研究旨在观察研究胃泌素受体拮抗剂（丙谷胺）及人工合成的八肽生长抑素（奥曲肽）对人大肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响，探讨丙谷胺与生长抑素对大肠癌细胞增殖的具体调控机制。

HMG盒蛋白1抑制巨噬细胞移动抑制因子启动子的转录激活

HMG盒蛋白1(HMG box-containing protein 1,HBP1)是一种转录抑制因子.HBP1表达上调可抑制肿瘤细胞的增殖和转移,并且在肿瘤细胞中HBP1常常发生丢失或转位,这表明HBP1是一种抑癌基因.HBP1所调节的靶基因无疑将为HBP1的肿瘤抑制机制提供新的线索.本研究通过生物信息学分析发现,在促细胞增殖基因-巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)启动子区域-811 bp至-792 bp发现高亲和力的HBP1反应元件.缺失和突变分析表明,HBP1通过该元件抑制MIF启动子活性.此外,免疫共沉淀研究显示,HBP1在细胞内与该元件结合,并且抑制MIF的转录.功能分析进一步证实,在细胞培养液中加入重组MIF可部分消除HBP1对大肠癌细胞LOVO的抑制作用.这些结果提示,MIF是HBP1的一个靶基因.HBP1通过抑制促细胞增殖基因MIF的表达抑制肿瘤细胞生长.

β-榄香烯对结直肠癌LoVo细胞株化疗增敏及细胞凋亡作用的研究

本研究旨在观察β-榄香烯对5氟尿嘧啶(5-Fu)辅助抑制结直肠癌细胞的作用。一、材料与方法1.细胞株:结直肠癌LoVo细胞株购自中科院上海细胞库。2.设置不同浓度β-榄香烯实验组及5-Fu实验组,作用24、48、72h后,用细胞噻唑蓝(MTT)比色法测试抑制率,并进行平板克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期、膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙锭(PI)双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。

大蒜素及联合CPT-11对人结肠癌LoVo细胞的杀伤作用

目的:探讨大蒜素对人结肠癌LoVo细胞增殖的影响及其与CPT-11联合使用时的化疗增敏作用。方法:不同浓度的大蒜素作用于体外培养的LoVo细胞,采用MTT法检测大蒜素对LoVo细胞增殖抑制能力;Annexin V-FITC标记流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞的凋亡抑制率;流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞周期影响;4.0,8.0 mg.L-1大蒜素联合CPT-11使用,观察CPT-11抗肿瘤活性的改变。结果:大蒜素可抑制LoVo细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,24,48,72 h IC50分别为32.23,10.74,6.58 mg.L-1,大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,作用24 h细胞凋亡随着大蒜素浓度增高而增高,作用48h凋亡作用峰值质量浓度为8 mg.L-1,大蒜素作用LoVo细胞24 h,质量浓度低于4 mg.L-1时细胞周期被阻滞于G2/M;而高于4 mg.L-1时细胞周期被阻滞于G2/M和G1期,4.0,8.0 mg.L-1大蒜素预处理24 h后,CPT-11作用LoVo细胞24 h IC50分别由单独使用的47.5 mg.L-1下降为7.4,7.2 mg.L-1,使CPT-11杀伤肿瘤效率分别提高6.4,6.6倍。结论:大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞增殖;低剂量大蒜素与CPT-11联合使用具有协同抗肿瘤作用。