人子宫内膜腺上皮细胞原代培养方法的改进

目的改进子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法,以使其可作为功能失调性子宫出血(功血,DysfunctionalUterine Bleeding,DUB)的体外实验模型之一。方法在取材、培养条件和细胞纯化等方面对子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法作了改进。结果34份标本,23份获得成功。培养时间为4～22d,无1例发生污染。接种后的5～6d为进行实验的最佳时间。结论改进后的子宫内膜腺上皮细胞原代培养法克服了污染问题,增加了可获得的细胞数。子宫内膜腺上皮细胞的分离、培养可作为功血的体外实验模型之一。

人子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离方法的研究

目的 探索子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离的新方法。方法 通过胶原酶阶梯消化 (0 2 5 % ,0 15 % ,0 1% ,0 0 8% )、不同目次的筛网过滤、重力沉降等技术得到高纯度的人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。结果 应用浓度逐渐降低的胶原酶消化子宫内膜组织 ,可提高细胞的存活率及细胞收集量。筛网过滤和重力沉降法 ,可提高子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的纯度 ,腺上皮细胞可达 90 % ,基质细胞可达 96 %以上。结论 采用此方法可得到大量高纯度的子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞 。

大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响

目的 探讨植物雌激素—大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响。方法 应用MTT比色方法研究大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响。结果 低浓度 (0 0 0 0 5～ 0 0 5mg/L)时 ,随着剂量的增加表现出刺激子宫内膜增殖的作用。高浓度 (0 0 5～ 5mg/L)时 ,随着剂量的增加大豆异黄酮刺激子宫内膜增殖的幅度下降。结论 大豆异黄酮能起到促进子宫内膜细胞增殖的作用 。

NES1在人子宫内膜腺上皮细胞及子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达

目的:研究正常上皮细胞特异性-1基因(normal epithelial cell specific-1,NES1)在人正常子宫内膜腺上皮细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达。方法:原代培养人子宫内膜腺上皮细胞,用免疫荧光定量PCR及Western blot的方法检测NES1在子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中的表达。结果:成功培养人子宫内膜腺上皮细胞;NES1在正常人子宫内膜腺上皮细胞中表达,表达定位在细胞质。NES1在Ishikawa细胞中表达较在子宫内膜腺上皮细胞中明显降低(P<0.05)。结论:NES1基因表达缺失可能是子宫内膜癌的发生机制。

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。

孕酮对培养人子宫内膜腺上皮细胞HOXA11基因表达的影响

目的研究孕激素对人子宫内膜腺上皮HOXA11基因表达的影响,初步探讨其影响机制。方法6例增殖期子宫内膜腺上皮细胞进行原代培养,在细胞生长汇合时,分别加入孕酮或孕酮+17β-雌二醇;米非司酮(RU486)预处理后加入孕酮或孕酮+17β-雌二醇培养4、68、d,提取细胞总RNA。用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HOXA11基因表达量。结果在原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞中加入孕酮或孕酮+17β-雌二醇,第4天时HOXA11基因表达量增加,第6天达高峰,第8天时有所下降;孕酮+雌激素的作用无叠加效应;经RU 486预处理后,上述作用消失。结论孕酮对原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞HOXA11基因的表达具有正调控作用,这种作用由孕酮受体介导。

缺氧状态下has-miR-215-5p通过抑制BLCAP的表达调控子宫内膜腺上皮细胞增殖和迁移

目的探究缺氧状态下的子宫内膜腺上皮细胞(EEC)增殖和迁移的可能机制。方法分别提取缺氧(1%氧浓度,缺氧组)和常氧(21%氧浓度,常氧组)条件下EEC的RNA进行高通量测序(RNA-sequence),分析两组细胞中微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法对差异表达的miRNA即has-miR-215-5p进行鉴定,通过miRNA靶基因数据库网站(Target Scan)分析has-miR-215-5p的靶基因。Western Blot检测两组细胞中靶基因膀胱癌相关蛋白(BLCAP)的蛋白表达水平,细胞计数实验检测两组EEC的增殖情况,划痕实验检测两组EEC的迁移能力。结果测序结果显示,缺氧组EEC中has-miR-215-5p表达显著上升(P<0.001),RT-qPCR验证结果与测序结果一致。miRNA Target Scan数据库检索结果显示,BLCAP是has-miR-215-5p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验结果显示has-miR-215-5p与BLCAP-3’-UTR结合,结合位点突变后结合活性消失。Western Blot结果显示,与常氧组相比,缺氧组EEC中的BLCAP蛋白表达显著下降(P<0.001)。CCK-8及划痕实验分别提示与常氧组相比,缺氧组的EEC增殖能力显著降低、迁移能力显著增强(P<0.001)。结论缺氧条件下EEC中has-miR-215-5p可能通过与BLCAP-3’-UTR结合,抑制BLCAP的表达活性,导致EEC的增殖降低与迁移增强。

雌激素剂量对宫腔镜宫腔粘连分离术后子宫内膜上皮化、内膜腺管密度的影响

目的:探究雌激素剂量对宫腔镜宫腔粘连分离术(TCRA)后子宫内膜上皮化、内膜腺管密度的影响。方法:选取2022年1月—2023年6月本院收治的80例宫腔粘连(IUA)患者为研究对象,所有患者行TCRA并于术后给予常规治疗,并随机分为小剂量组和大剂量组,各40例,小剂量组采用口服雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(1mg/10mg)治疗,大剂量组采用口服戊酸雌二醇片(3mg)+地屈孕酮片(10mg)治疗。比较治疗3个月经周期后两组患者的治疗效果和粘连复发情况,监测两组患者治疗前后的子宫内膜厚度、宫腔容积情况和以CD34标记的血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)水平,记录治疗期间两组患者不良反应发生情况。结果:治疗3个月经周期后大剂量组的治疗总有效率明显高于小剂量组(P<0.05),两组粘连复发率对比无统计学差异(P>0.05);两组患者的子宫内膜厚度均较治疗前明显降低,内膜容积明显扩大(P<0.05),VEGF和MVD水平均较治疗前明显提高,且大剂量组内膜厚度的降低程度与内膜容积的扩大程度、VEGF和MVD水平提高幅度均较小剂量组更显著(P<0.05)。治疗期间两组患者发生的不良反应主要为乳房胀痛、头痛恶心及皮肤过敏,两组不良反应总发生率对比无统计学差异(P>0.05)。结论:大剂量雌激素应用于TCRA后较小剂量的效果更好,且安全性良好,有助于加快患者子宫内膜与宫腔容积恢复正常,有利于促进内膜上皮化及微血管形成。

桂楼复方对子宫腺肌病异位内膜细胞迁移和侵袭的影响研究

背景子宫腺肌病(AM)是妇科常见的疑难病,但其具体机制尚未明确。中医药治疗AM有一定优势,前期研究显示,桂楼复方宫内缓释系统可明显降低AM模型大鼠子宫内膜细胞增殖、侵袭能力。目的探讨桂楼复方对子宫腺肌病异位内膜细胞(AMDC)迁移、侵袭的影响,并研究其对Rho/ROCK信号通路的影响。方法本研究于2021年10月—2023年4月在山东中医药大学附属医院实验中心完成。使用CCK-8法检测AMDC细胞活力并筛选最佳药物浓度。设置空白组,使用桂楼复方(50、100 mg/L)处理AMDC,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,免疫印迹法Western Blotting)/实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCK1、ROCK2在蛋白和mRNA水平的表达情况。Rescue实验中使用激动剂U-46619(1μmol/L)和桂楼复方(100 mg/L)处理AMDC,Western Blotting法检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达改变情况。结果与空白组比较,100 mg/L桂楼复方干预后AMDC细胞存活率未明显降低,差异无统计学意义(P>0.05),是不影响细胞活性的最佳药物浓度。选取50、100 mg/L桂楼复方进行后续实验。与空白组比较,桂楼复方50 mg/L、100 mg/L组AMDC迁移、侵袭能力受到抑制(P<0.001),RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白及mRNA表达水平下调(P<0.001),U-466191μmol/L组RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达上调(P<0.001)。与U-466191μmol/L组比较,U-466191μmol/L联合桂楼复方100 mg/L组RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达下调(P<0.001)。空白组与桂楼复方50 mg/L、100 mg/L组RhoB的蛋白及mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论桂楼复方可有效抑制AMDC的迁移、侵袭能力,不影响细胞活性的最佳药物浓度为100 mg/L,桂楼复方可下调RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白及mRNA表达水平,并可逆转U-46619对RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平的上调作用,从而抑制AM病局部异位病灶的持续进展,其作用可能与调控Rho/ROCK通路密切相关。

子宫内膜腺上皮及基质细胞分离、培养作为子宫内膜异位症体外细胞模型的探索

目的 :探索在位子宫内膜腺上皮及基质细胞的分离、培养作为子宫内膜异位症 (EMs)的体外细胞模型。方法 :通过酶解、系列过滤、沉降及贴壁纯化等技术 ,分离、纯化及培养 15份EMs患者的在位子宫内膜腺上皮细胞及其基质细胞 ,并拟传代。结果 :11份标本获得成功 ;每 1g新鲜子宫内膜组织可得到 (8～ 12 )× 10 6个原代基质细胞及 (4～ 8)× 10 6个原代腺上皮细胞 ;基质细胞纯度率可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度率约为90 %。基质细胞可以有限的传代 ,腺上皮细胞不能传代。通过改良步骤 ,可提高基质细胞的产量。结论 :在位子宫内膜腺上皮及其基质细胞的分离、培养可作为EMs的体外细胞模型之一。

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的 :探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法 ,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型。方法 :通过消化、过滤、沉降等方法 ,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞 ,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法 ,光学显微镜观察离体细胞形态。结果 :正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达 91.7% (11/ 12 ) ,子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为 93.8% (15 / 16 ) ,子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为 75 .0 % (12 / 16 )。间质细胞传代 2次后 ,生长缓慢 ,经雌激素作用后 ,生长明显改善 ;腺上皮细胞不能传代 ,经雌激素作用后 ,生长改善不明显。结论 :体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点 ,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一。

山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离培养和鉴定

为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离、生长条件以及纯度鉴定，通过2g／L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4h，200目的滤网过滤后进行低速离心，收集沉淀物，沉降洗涤3～5次，将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养。12h后开始贴壁生长，腺团开始向外部扩散，生长2～3d，细胞扩散并出现明显的铺路石状，4～5d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长。经免疫组织化学方法进行细胞染色，细胞表达角蛋白的阳性率达90％以上。

猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养

为了获得高纯度的猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,对猪子宫内膜进行胶原酶消化,分离基质细胞和腺上皮细胞进行体外培养,研究其生长特性。结果表明:猪子宫内膜组织在37℃、通过1 g/L胶原酶Ⅰ消化90 min可以获得游离的腺体,对腺体进行培养时上皮细胞比例可达70%以上。培养过程中采用差速消化和差速贴壁可以成功分离腺上皮细胞和基质细胞。基质细胞最适贴壁时间为25 min,腺上皮为3 h。纯化的基质细胞生长迅速,可传5代以上,上皮细胞生长缓慢,并且成片脱落。

高纯度分离子宫内膜腺上皮及间质细胞和体外培养技术

【目的】探索一种简便、高纯度分离在位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的方法,建立高纯度体外子宫内膜细胞培养模型。【方法】选择正常的新鲜子宫内膜组织20例,通过酶解,过滤及贴壁纯化等技术,每例均用Ryan方法(对照组)及改良的新方法(改良组)分离、纯化及培养子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞,并进行传代。【结果】18例标本获得成功,对照组分离的间质细胞纯度为(84.22±5.17)%,腺上皮细胞纯度为(62.11±6.23)%;改良组分离的间质细胞纯度达(97.89±0.96)%,腺上皮细胞纯度(95.12±2.11)%,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.01)。【结论】改良方法简便,可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。在体外建立高纯度子宫内膜细胞培养模型,更利于在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及干预调节。

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90%以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91%,基质细胞的活率为78%。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的:建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法,为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法:15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养,光镜观察,应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果:正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功;5例异位内膜标本获得成功,基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95%以上,并均可传代。结论:采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功,有助于研究子宫内膜异位症的发病机制,为临床实验提供重要的理论依据。

稳定沉默水通道蛋白5基因对异位子宫内膜腺上皮细胞增殖及迁移的影响

目的：探讨水通道蛋白（AQP）5基因对异位子宫内膜腺上皮细胞增殖及迁移的影响。方法：构建可靶向沉默AQP5基因的质粒，在293 T细胞中包装形成病毒颗粒后，感染原代培养的异位子宫内膜腺上皮细胞，分别通过逆转录PCR及蛋白质印迹法鉴定异位子宫内膜腺上皮细胞中AQP5 mRNA和蛋白表达。 MTT法测定细胞增殖；Transwell技术检测细胞的体外迁移能力；蛋白质印迹法检测丝氨酸／苏氨酸蛋白酶（ AKT ）活化情况。构建裸鼠腹腔内子宫内膜异位症体内模型，考察阴性对照组和AQP5沉默组子宫内膜腺上皮细胞在裸鼠腹腔内瘤体生长情况及腹膜转移情况。结果：体外实验结果显示，AQP5沉默后异位子宫内膜腺上皮细胞的增殖能力在第7天时明显抑制（ P＜0．05）；AQP5沉默组异位子宫内膜腺上皮细胞磷酸化（ p－AKT）表达减少，而AKT表达无改变，p－AKT／AKT减少（ P＜0．05）；AQP5沉默组比阴性对照组迁移细胞数减少（ P＜0．05）。体内实验结果显示，与阴性对照组比较，AQP5沉默组瘤体结节数相对较少，体积较小，其中腹膜瘤体结节数少于阴性对照组（ P＜0．05）。结论：AQP5基因沉默可抑制异位子宫内膜腺上皮细胞的增殖及迁移能力，其机制可能与AKT活化有关。

褪黑素通过改善线粒体动力学缓解棕榈酸诱导的牛子宫内膜上皮细胞损伤

旨在探究褪黑素对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells,BEECs)线粒体动力学的影响及机制。本试验以BEECs为研究对象,分为3组:对照组、PA组和褪黑素组,其中,对照组添加0.2 mmol·L^(-1)BSA溶剂,PA组添加0.2 mmol·L^(-1)PA,褪黑素组同时添加0.2 mmol·L^(-1)PA和100 nmol·L^(-1)褪黑素。本研究通过CCK8法(n=4)和Annexin V-FITC/PI双染法(n=3)检测细胞活力和凋亡情况;利用细胞流式术检测细胞线粒体内的ROS水平(n=3);进一步使用Seahorse XFe96细胞代谢呼吸动态分析仪检测耗氧率、基础呼吸值、ATP合成能力等线粒体呼吸功能的相关指标(n=4);qRT-PCR法检测线粒体动力学相关基因MFN1、DRP 1和PGC1-α的mRNA表达变化量(n=3);最后通过Western-Blot法检测线粒体动力学相关蛋白MFN1、p-DRP1、DRP1和PGC1-α的表达变化量(n=3)。结果显示:与PA组相比,1)添加褪黑素能显著降低BEECs线粒体ROS水平(P<0.05),并显著提高BEECs活力和显著降低BEECs凋亡率(P<0.05);2)Seahorse结果提示,添加褪黑素能显著提高线粒体基础呼吸值、ATP产量和最大耗氧量(P<0.05),此结果表明褪黑素能改善线粒体功能,促进线粒体有氧呼吸,增加ATP产量;3)qRT-PCR结果表明,添加褪黑素能显著降低MFN1、DRP 1的mRNA表达量,显著提高PGC1-α的mRNA表达量(P<0.05);4)Western-Blot检测发现褪黑素组中MFN1蛋白表达量显著下降(P<0.05),p-DRP1/DRP1和PGC1-α蛋白表达量显著上升(P<0.05)。综上,本研究表明褪黑素可能通过改善BEECs线粒体动力学功能,从而缓解PA诱导下的线粒体氧化应激和提高线粒体呼吸功能,最终增强BEECs活力和降低BEECs凋亡;本研究初步探究了褪黑素对PA诱导BEECs损伤的作用机制,为提高严重NEB奶牛低繁殖力提供了理论依据。

高纯度子宫内膜腺上皮细胞的体外分离和培养

目的:在体外建立子宫内膜腺上皮细胞原代分离和培养的方法,以获得高纯度子宫内膜腺上皮细胞。方法:选择正常子宫内膜组织,通过消化、过滤、选择性贴壁和二次消化等技术进行体外培养。结果:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法成功实现子宫内膜腺上皮细胞的高纯度分离和原代培养。结论:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。