豆腐果苷对人孕烷X受体介导的CYP3A4和MDR1的转录调节作用

目的:建立和验证人孕烷X受体(human pregnant X receptor,hPXR)介导的CYP3A4、MDR1药物诱导剂的体外筛选体系,考察豆腐果苷对hPXR介导的CYP3A4、MDR1的转录调节作用。方法:利用构建的双荧光素酶报告基因系统,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,以10μmol/L利福平为阳性对照,用不同浓度(0.004、0.04、0.4μmol/L)豆腐果苷处理48h后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测。结果:不同浓度的豆腐果苷均不能通过激活hPXR来介导CYP3A4和MDR1表达上调,各浓度处理组的双荧光素酶比活性值与DMSO溶媒组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建了hPXR介导的CYP3A4和MDR1药物诱导剂的体外筛选体系,并发现豆腐果苷不能通过激活hPXR介导CYP3A4和MDR1的表达上调。

慢病毒介异的孕烷X受体sh-RNA稳定干扰HepG2细胞株的构建

目的:构建慢病毒介导的人孕烷X受体(hPXR)sh-RNA干扰载体及筛选肝癌细胞稳定干扰株。方法:针对hPXR的特异性序列,设计干扰序列,构建重组克隆。转染HEK293T细胞,筛选有效干扰片段。HEK293T包装干扰病毒并转染肝癌HepG2细胞株,200 mmol/L嘌呤霉素筛选2-3周,Western blot检测PXR表达。hPXR激动剂利福平处理PXR sh-RNA稳定干扰肝癌HepG2细胞株和Scramble对照细胞,抽提RNA并鉴定hPXR靶基因细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的表达。结果:筛选出了PXR有效干扰片段,并获得了PXR信号通路有效敲低的HepG2慢病毒稳定干扰株。结论:成功构建了慢病毒介导的PXR sh-RNA稳定干扰HepG2细胞株。

何首乌中THSG和蒽醌类成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

该文探讨何首乌主要化学成分2,3,5,4'-四羟基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucopyranoside,THSG)、蒽醌类(大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚)对人孕烷X受体(human pregnant X receptor,PXR)介导的CYP3 A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3 A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察何首乌中主要化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3 A4转录调控区的报告基因载体共转染Hep G2细胞,10μmol·L^(-1)利福平(RIF)为阳性对照,10μmol·L–1酮康唑(TKZ)为阴性对照,用THSG(2.5,5,10μmol·L^(-1))和蒽醌类成分(2.5,5,10μmol·L^(-1))分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3.1与p GL4.17-CYP3A4共转染时,THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素对CYP3A4的调控多为抑制效应,大黄素对CYP3A4产生诱导作用;pc DNA3.14-PXR与p GL4.17-CYP3A4共转染时,THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素均产生诱导效应。综上,THSG和蒽醌类成分均可对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,上述成分对CYP3A4均产生诱导效应,提示何首乌中主要成分对CYP3A4的诱导作用是通过PXR实现的。以上结果提示在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高中药的安全性和有效性。

人孕烷X受体介导的UGT1A1报告基因模型的建立及初步应用

目的建立基于人孕烷X受体(human pregnane X receptor,hPXR)的UGT1A1的报告基因模型,研究中药提取物通过人孕烷X受体途径对UGT1A1的潜在诱导能力。方法以人基因组DNA为模板扩增UGT1A1的远端和近端启动子,连接到pGL3载体上,构建pGL3-PXRE重组质粒,并与人孕烷X受体表达质粒共转染HepG2细胞,从而建立报告基因模型。运用该模型考察了9种常见中药对人孕烷X受体的激活作用,即对UGT1A1的潜在诱导作用。结果将UGT1A1启动子片段克隆到pGL3载体上,构建了pGL3-PXRE重组质粒,成功构建了报告基因模型,并考察了多种常见中药的提取物通过人孕烷X受体途径对UGT1A1的诱导作用。结论成功地建立了基于人孕烷X受体的UGT1A1的报告基因模型,为人孕烷X受体激活剂的体外筛选提供了一种有效的方法。

外源化合物对孕烷X受体和组成型雄烷受体介导的细胞色素P4503A4和2B6转录调节共转染体系的优化

目的优化孕烷X受体(hPXR)和组成型雄烷受体(hCAR)介导的细胞色素P450(CPY)3A4和CYP2B6诱导共转染体系,提高检测系统的灵敏度。方法利用invitrogen脂质体2000共同转染表达质粒hPXR/hCAR、报告基因质粒CPY3A4/CYP2B6和内参质粒pRL-TK到HepG-2细胞中。系统以hPXR的激动剂利福平,hCAR的激动剂CITCO为阳性对照组,以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂阴性对照组。通过调整3种质粒的转染比例,以利福平/DMSO和CITCO/DMSO的比活值,即阳性药物的诱导倍数作为优化系统灵敏度的指标,分别获得最大比值以表示系统具有最佳灵敏度。结果当共转染体系比例为hPXR/hCAR表达质粒150ng、CPY3A4/CYP2B6报告基因质粒600ng、PLR-TK内参质50ng时,转染体系的检测灵敏度最高。结论针对所使用的转染细胞系和共转染质粒,通过优化质粒的转染比例可提高系统的灵敏度,优化的共转染系统可用于药物代谢酶诱导机制的研究。

何首乌6种成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

该文探讨何首乌中6种化学成分(没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素)对人孕烷X受体(humanpregnant X receptor,PXR)介导的CYP3A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞,10μmol·L-1利福平为阳性对照,10μmol·L-1酮康唑为阴性对照,用何首乌中6种成分--没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素(5,10,20μmol·L-1)分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3. 1与p GL4. 17-CYP3A4共转染时没食子酸、白藜芦醇对CYP3A4的调控为抑制效应,槲皮素、山柰酚、木犀草素对CYP3A4产生诱导作用;pc DNA3. 14-PXR与p GL4. 17-CYP3A4共转染时,槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素均产生诱导效应。综上所述,6种成分对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,5种成分对CYP3A4产生诱导效应,其中3种成分的诱导效应具有显著性差异。该研究提示,在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高安全性和有效性。

药食两用物质效用成分对人孕烷X受体的激活效应及细胞增殖抑制筛选

目的:探讨药食两用物质甘草(甘草苷、甘草酸)、鱼腥草(槲皮素、鱼腥草素)、夏枯草(迷迭香酸)、决明子(橙黄决明素)、茯苓(茯苓酸)、百合(百合皂苷、秋水仙碱)、枸杞子(枸杞多糖)7种药食两用物质中10种效用成分对人孕烷X受体(PXR)的激活效应并筛选其潜在的毒性成分。方法:利用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法考察了甘草苷、甘草酸、槲皮素、鱼腥草素、迷迭香酸、橙黄决明素、茯苓酸、秋水仙碱(10、20、50μmol·L^(-1))、百合皂苷、枸杞多糖(10、20、50 mg·L^(-1))10种成分对正常的人肝细胞(L02)增殖抑制的影响;通过生化分析仪检测药物处理后对L02细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响;Hoechst 33342染色考察了10种效用成分对L02细胞凋亡的影响;利用分泌型荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含细胞色素P4503A4(CYP3A4)转录调控区的报告基因载体共转染L02细胞,10μmol·L^(-1)利福平(RIF)为阳性对照,用甘草苷、甘草酸、槲皮素、鱼腥草素、迷迭香酸、橙黄决明素、茯苓酸、秋水仙碱(5、10、20μmol·L^(-1))和百合皂苷、枸杞多糖(5、10、20 mg·L^(-1))10种成分分别处理24 h,进行荧光素酶活性检测。结果:与空白组比较,秋水仙碱、百合皂苷、槲皮素会导致细胞活力呈浓度依赖性降低(P<0.05,P<0.01),槲皮素、迷迭香酸、甘草酸、秋水仙碱、橙黄决明素、茯苓酸可以增加L02细胞中LDH的释放率(P<0.05,P<0.01),迷迭香酸、甘草苷、枸杞多糖处理后部分细胞的高亮浓染细胞核的比例逐渐上升(P<0.05,P<0.01);pcDNA3.1-PXR与pGLuc-CYP3A4共转染L02细胞时,与空白组比较,橙黄决明素、茯苓酸对PXR有激活效应(P<0.05),甘草苷、甘草酸对PXR有抑制效应(P<0.05)。结论:在长期服用药食两用物质时,应注意其对药物代谢酶的影响及可能产生的相互作用,提高药食两用物质的安全性。

4种中药调节细胞色素P4503A4转录表达的研究

目的:从中药中筛选通过激活人孕烷X受体(PXR)诱导细胞色素P450 3A4(CYP3A4)转录表达的中药;研究其诱导能力与药物浓度和作用时间之间的关系。方法:在HepG2细胞中,采用瞬时共转染报告基因试验筛选对CYP3A4转录表达有诱导作用的中药,研究其在不同浓度和不同作用时间下对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用。结果:中药莪术、苍术、白术和茯苓均能通过激活PXR诱导CYP3A4的转录表达,且具有浓度-效应关系和时间-效应关系。在浓度-效应关系中,500 mg.L-1的莪术、苍术、白术和茯苓,在作用时间24 h时,其诱导倍数分别为0.1%DMSO处理细胞的(6.82±0.09),(6.76±0.20),(5.49±0.13),(4.97±0.07)倍。在时间-效应关系研究中,500 mg.L-1的莪术、苍术、白术和茯苓,在作用时间为48 h时,其诱导倍数分别为0.1%DMSO作用细胞的(7.74±0.54),(7.34±0.10),(5.54±0.11),(5.32±0.18)倍。结论:中药莪术、苍术、白术和茯苓均能够通过激活PXR诱导CYP3A4的转录表达。